Анализ теломерных взаимодействий белка и ДНК с помощью одномолекулярного магнитного пинцета
30 августа 2024 г.
Этот протокол демонстрирует использование одномолекулярного магнитного пинцета для изучения взаимодействий между теломерными ДНК-связывающими белками (фактор повторного связывания теломер 1 [TRF1] и TRF2) и длинными теломерами, извлеченными из клеток человека. В нем описываются подготовительные этапы для теломер и теломерных факторов связывания повторов, проведение экспериментов с одиночными молекулами, а также методы сбора и анализа данных.
Для изучения теломерного взаимодействия белка и ДНК были использованы одномолекулярные методы. Тем не менее, получение одномолекулярных конструкций с теломерными повторяющимися мотивами остается сложной задачей. В этом протоколе мы описываем этапы экспрессии и очистки белка TRF2, подготовки теломерной ДНК, постановки одномолекулярных механических анализов и анализа полученных данных.
Инструменты с использованием одной молекулы являются мощными методами для изучения теломерных взаимодействий белка и ДНК. Одномолекулярные механические методы, такие как магнитный пинцет, оптический пинцет и АСМ, были использованы для исследования TRF2-зависимого искажения ДНК, выявления TRF2-опосредованного столбчатого стекирования теломерного хроматина человека и наблюдения за присутствием теломеразного катализа. Мы исследовали теломерные взаимодействия ДНК-белка с помощью одиночного молекулярного магнитного пинцета, что позволило точно измерить изменения в длине и продолжительности белок-ДНК-взаимодействий под действием приложенных сил.
На основе этих измерений мы вывели кинетику диссоциации теломерных комплексов ДНК-белок. Кроме того, было выявлено образование петель внутри этих комплексов. Многочисленные структуры теломер-связывающих белков в комплексе с ДНК были определены с помощью крио-ЭМ, рентгеновской кристаллографии и ЯМР.
Эти структурные открытия углубили наше понимание теломерных взаимодействий белка и ДНК. Для дальнейшего изучения динамики этих взаимодействий мы разработали одномолекулярные механические методы, специально предназначенные для изучения теломерных взаимодействий белка и ДНК. Инструменты с использованием одной молекулы являются мощными методами исследования взаимодействий белка и ДНК в теломерах.
Эти методы особенно ценны для топологических конформаций и анализа кинетики ассоциации и диссоциации белок-ДНК.
Обзор
В данном протоколе описывается использование одномолекулярных магнитных пинцетов для исследования взаимодействий между теломерными ДНК-связывающими белками TRF1 и TRF2 и теломерами человека. Подробно изложены этапы подготовки теломер и белков, проведения экспериментов, а также методы сбора и анализа данных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биофизика
- Молекулярная биология
Теоретические сведения
- Методы анализа одиночных молекул имеют важное значение для изучения взаимодействий между белками и ДНК.
- Подготовка конструктов с теломерными повторяющимися мотивами представляет собой сложную задачу.
- TRF2 играет ключевую роль в структуре теломерного хроматина.
- Магнитные пинцеты позволяют проводить высокоточные измерения молекулярных взаимодействий.
Цель исследования
- Продемонстрировать применение магнитных пинцетов для изучения взаимодействий теломерных белков.
- Представить подробный протокол подготовки TRF2 и теломерной ДНК.
- Проанализировать механические свойства ДНК при связывании с белком.
Используемые методы
- Экспрессия и очистка белка TRF2.
- Подготовка конструкций теломерной ДНК.
- Настройка одномолекулярного механического анализа с использованием магнитных пинцетов.
- Сбор данных и анализ белково-ДНК взаимодействий.
Основные результаты
- Успешное получение TRF2 и теломерной ДНК для проведения экспериментов.
- Демонстрация TRF2-зависимой деформации ДНК под воздействием механических сил.
- Выявление особенностей активности теломеразы и структуры хроматина.
- Создание основы для дальнейших исследований теломерных взаимодействий.
Выводы
- Методы изучения отдельных молекул являются мощным инструментом для исследования теломерных белков.
- Данный протокол упрощает изучение взаимодействий между ДНК и белками.
- Полученные результаты способствуют пониманию биологии теломер.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Магнитные пинцеты для анализа одиночных молекул позволяют проводить точное количественное исследование взаимодействий между теломерными белками и ДНК, что напрямую способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах разработки онкологических препаратов. Путем определения кинетики диссоциации и формирования петель TRF1/TRF2 на полноразмерной теломерной ДНК человека данный подход повышает прогностическую достоверность на стыке фундаментальной биологии и трансляционных исследований. Метод помогает в принятии решений по портфелю препаратов, проясняя функциональное воздействие потенциальных модуляторов на механизмы поддержания теломер.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Позволяет напрямую измерять кинетику связывания TRF2 и TRF1 с теломерной ДНК для функциональной валидации мишени.
- Обеспечивает снижение механистических рисков за счет количественной оценки вызванного белком искажения ДНК и образования петель.
- Повышает прогностическую достоверность при определении приоритетности теломер-ассоциированных мишеней в онкологических разработках.
Скрининг и разработка анализа
- Облегчает подготовку валидированных теломерных конструкций ДНК для последующих процессов скрининга.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные данные о силе растяжения и диссоциации для стандартизации анализа.
- Позволяет надежно оценивать влияние соединений на белок-нуклеиновые взаимодействия на уровне отдельных молекул.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует биологии теломер при заболеваниях благодаря использованию полноразмерных субстратов теломерной ДНК человека.
- Поддерживает разработку трансляционных биомаркеров посредством кинетических и структурных показателей белково-ДНК-выхлопов.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации, связывая молекулярный механизм с функциональной защитой теломер.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный одномолекулярный механический анализ связывает этапы первичного поиска, идентификации ведущих соединений и трансляционных исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез путем изучения взаимодействий между теломерными белками и ДНК.
- Биология открытий: Количественная оценка кинетики диссоциации и формирования петель для выяснения функции TRF2/TRF1 в поддержании теломер.
- Скрининг: Обеспечение стандартизированных, воспроизводимых измерений зависимости силы от растяжения для оценки соединений.
- Аналитика: Получение количественных данных, таких как зависимые от силы скорости диссоциации, что позволяет проводить надежное сравнение различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Связь данных о молекулярных взаимодействиях с динамикой теломер, имеющей значение для заболеваний, и стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное использование: Создание многократного используемой платформы для механистических исследований белково-нуклеиновых взаимодействий в биологии теломер и смежных областях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при поиске лекарственных средств, нацеленных на теломеры.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные масштабируемые методы анализа единичных молекул для развертывания в рамках различных программ.
- Стратегическая ценность: служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), а также для распределения капитала путем уточнения степени взаимодействия с мишенью и функциональных результатов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию агентов, модулирующих теломеры, в портфелях препаратов для онкологии и борьбы со старением с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области экспрессии белков, подготовки ДНК и биофизики единичных молекул.
- Необходим доступ к установке магнитных пинцетов и инфраструктуре для количественного получения изображений.
- Требуется строгая стандартизация протоколов подготовки конструктов и анализа данных между разными исследовательскими группами.
- Может потребоваться адаптация для белков различных вариантов или теломерных последовательностей разной длины.
- Подготовка конструктов с повторяющимися теломерными мотивами остается технически сложной задачей и может ограничивать пропускную способность.
