Мониторинг индуцированных электропорацией изменений в генерации потенциала действия в генетически модифицированных ячейках HEK с Tet-on

Электропорация временно увеличивает проницаемость клеточных мембран с помощью высоковольтных электрических импульсов. Существует несколько быстро развивающихся клинических методов лечения, основанных на электропорации, которые нацелены на мышечные и нейронные клетки. Таким образом, крайне важно изучить, как электропорация влияет на способность этих возбудимых клеток запускать потенциалы действия.

Эксперименты in vitro очень важны для понимания влияния электропорации на возбудимые клетки. Тем не менее, первичные миоциты и нейроны имеют очень сложный профиль экспрессии ионных каналов, что делает чрезвычайно сложным распутывание взаимодействия между возбуждением и электропорацией. Мы разработали протокол для мониторинга вызванных электропорацией изменений в генерации потенциала действия с использованием ГЭК-ячеек с использованием ГЭК-ячеек.

Эти клетки экспрессируют минимальный набор натриевых и калиевых каналов, которые делают их возбудимыми. Таким образом, эта ячейка упростила эксперименты и теоретический анализ полученных результатов. Используя наш протокол, мы обнаружили, что очень мягкая электропорация уже может значительно повлиять на приемлемость клеток.

Эти результаты проложат путь к разработке теоретических моделей электропорации и приемлемости клеток, и это поможет сообществу улучшить быстро развивающиеся методы лечения на основе электропорации в сердце, мозге и скелетных мышцах. Для начала нанесите пипетку на один миллилитр PBS в одну лунку из двух предметных стекол. Добавьте 10 микролитров стерильного раствора поли-L-лизина из расчета один миллиграмм на миллилитр и хорошо перемешайте пипеткой.

Инкубировать в течение 1,5 часов при комнатной температуре в стерильных условиях в колпаке с ламинарным потоком, затем удалить PBS с поли-L-лизином без дальнейшего промывания. Чтобы засеять клетки, приготовьте развод стокового раствора доксициклина в соотношении один к 10 в питательной среде в пробирке объемом 1,5 миллилитра. Теперь извлеките питательную среду из колбы Т-25.

Трипсинизируйте клетки 2,5 миллилитрами раствора трипсина ЭДТА в углекислом инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух минут. Добавьте 2,5 миллилитра свежей питательной среды и аккуратно пипетируйте клетки, чтобы оторвать их от поверхности. Рассчитайте объем трипсинизированной клеточной суспензии, необходимый для формирования культуры.

Вычтите из 1 470 микролитров рассчитанный ранее объем клеточной суспензии, чтобы рассчитать объем питательной среды. Для получения образцов с возбудимыми S HEK клетками пипетируют рассчитанный объем питательной среды и трипсинизированной клеточной суспензии в одну лунку. Добавьте 30 микролитров разбавления доксициклина.

Хорошо перемешайте с помощью осторожного пипетирования непосредственно перед помещением камер в инкубатор с углекислым газом. Для получения образцов с невозбудимыми NS HEK клетками расчетный объем питательной среды пипетируют в лунку, и добавляют 90% расчетного объема клеточной суспензии для S HEK клеток без доксициклина. Инкубируйте камеры в инкубаторе с 5% содержанием углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех дней до начала эксперимента.

Перед экспериментом пипеткой наберите три микролитра потенциометрического раствора красителя в 1,5-миллилитровую пробирку. Оставьте открытую пробирку при комнатной температуре в ламинарном колпаке примерно на 15 минут, чтобы этанол испарился, а потенциометрический краситель высох, затем добавьте в пробирку 997 микролитров холодной питательной среды при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы растворить краситель до конечной концентрации 12 микромоляров. Далее извлеките питательную среду из лунки.

Добавьте в клетки один миллилитр раствора потенциометрического красителя. Охладите клетки при температуре четыре градуса Цельсия и инкубируйте их в течение 20 минут. После этого удалите раствор потенциометрического красителя и сохраните его в пробирке для дальнейшего повторного использования до шести последовательных экспериментов в течение одного дня.

Аккуратно промойте клетки трижды раствором тироды. После последнего промывки пипеткой налейте в лунку один миллилитр раствора тироды с низким содержанием калия. Для начала подготовьте ячейки HEK к электропорации, затем настройте синхронизацию доставки импульсов с получением изображения с помощью TTL-сигнала от микроскопической системы, которая запускает генератор импульсов.

На дно камеры поместите два параллельных электрода из платино-иридиевой проволоки диаметром 0,8 миллиметра и пятимиллиметровым расстоянием между внутренними краями. Закрепите камеру под микроскопом, после чего подключите электроды к генератору импульсов. С помощью щупа напряжения и тока подключите выход генератора импульсов к осциллографу, чтобы обеспечить возможность проверки правильности подачи импульсов во время эксперимента.

Сфокусируйте ячейки на светлом поле и визуализируйте ячейки, расположенные посередине между электродами. Получите 80 изображений в режиме интервальной съемки со скоростью не менее 25 кадров в секунду. Осветите клетки с длиной волны возбуждения 635 нанометров, установите время экспозиции на 10 миллисекунд и обнажите излучение на частоте около 700 нанометров.

После приобретения подождите две минуты. Отрегулируйте напряжение на интерфейсе генератора импульсов на 63 вольта. Записывайте таймлапс таким же образом каждые две минуты.

Во время этой съемки подайте один импульс длительностью 100 микросекунд в момент получения 10-го изображения. Получение изображений с импульсным напряжением 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 и 200 вольт. Оцените электрическое поле, воздействию которого подвергаются элементы, как отношение приложенного напряжения к электродному расстоянию.

Для анализа данных экспортируйте покадровые записи в формат TIFF, а затем поместите все покадровые записи приложенных напряжений из отдельного эксперимента в одну папку. Переименуйте каждую цейтраферную запись, чтобы MATLAB мог распознавать электрическое поле. Для получения данных в начале эксперимента, когда импульс не подается, переименуйте его, используя фразу 000Vcm.

Далее откройте приложение, скачанное с GitHub. Нажмите «Выбрать папку с данными», чтобы выбрать папку, содержащую покадровые записи одного эксперимента. Чтобы выбрать пиксели, используйте два ползунка, чтобы определить нижний порог для четкого изображения мембран и высокий порог для исключения мусора из анализа.

Теперь нажмите «Анализировать данные». Во вкладке "Анализ" появится таблица с извлеченными параметрами. В правой части таблицы будут отображены графики относительной флуоресценции во времени для каждого используемого электрического поля.

Выберите графики для заданного электрического поля из выпадающего меню в левой части над таблицей. Изучите все графики и выполните ручную коррекцию в случае обнаружения ложных пиков. выберите «Очистить АВТОПИКИ» в нижней части вкладки «Анализ», чтобы удалить автоматически обнаруженные пики.

Нажмите на график, чтобы вручную определить новую точку пикового времени. При необходимости выберите «Повторить автоматическое обнаружение пиков» в нижней части вкладки «Анализ», чтобы снова выполнить автоматическое обнаружение пиков. Извлеченные параметры теперь будут скорректированы в соответствии с новым пиком.

После этого выберите «Экспорт данных» в правом нижнем углу вкладки «Анализ», чтобы экспортировать данные в ту же папку, что и файл dotmap, файл электронной таблицы и изображения PNG для каждого используемого электрического поля. Электрические импульсы с напряжением 126 вольт на сантиметр вызывали множественные пики флуоресценции в возбудимых элементах, о чем свидетельствуют отчетливые колебания изменения флуоресценции с течением времени. С увеличением напряженности электрического поля реакция изменялась и демонстрировала устойчивую деполяризацию при напряжении 400 вольт на сантиметр.

Невозбудимые ячейки не демонстрировали значительных пиков в ответ на самые низкие напряжения электрического поля, что указывает на отсутствие возбуждения. При более высокой напряженности электрического поля невозбудимые клетки также демонстрировали устойчивую деполяризацию, что указывает на электропорацию. Максимальное число пиков в возбудимых элементах наблюдалось при напряжении 150 вольт на сантиметр, с тенденцией к уменьшению числа пиков по мере увеличения напряжения за пределами этой точки.