Протокол эксплантации культур IDH1-мутантных диффузных низкодифференцированных глиом

В нашей лаборатории мы специализируемся на редком типе опухолей головного мозга, который называется диффузными глиомами низкой степени злокачественности. Эти глиомы чаще всего поражают молодых людей, и они характеризуются мутацией в гене под названием IDH-1. Основным достижением в области глиом являются, во-первых, использование 3D-моделей, таких как опухолевые или органоидные, во-вторых, использование визуализации непосредственно в мозге мышей, которым трансплантированы глиомы, и, в-третьих, использование специальных транскриптомных и одноклеточных РНК.

Основная проблема, с которой мы сталкиваемся при работе с мутантными глиомами IDH-1, заключается в низкой пролиферации этих клеток и их трудностях для поддержания в культуре, и поэтому мы разработали и определили протокол для поддержания жизни клеток, и для некоторых из них мы смогли получить клеточную линию. Но не для всех пациентов. Изучая мутантные клетки IDH-1 in vitro, а также in vivo, мы обнаружили, что эти клетки довольно пластичны, и они могут принять судьбу двух клеток, будь то астроцитарными или овальными, и мы также обнаружили, что подталкивание играет важную роль в этой пластичности. С помощью этого нового протокола экспланта мы смогли поддерживать мутантные клетки IDH-1 in vitro в течение нескольких недель, но даже больше, в течение нескольких месяцев, и мы показали, что существуют различные типы опухолевых клеток, которые мы обнаружили у пациентов.

Мы также обнаружили, что существуют некоторые клетки опухолевого окружения, такие как клетки микроглии, которые позволяют изучать взаимодействие между опухолевыми клетками и окружающей их средой, поэтому эти модели предлагают более точное представление биологического разнообразия, обнаруженного в опухолях. Для начала подготовьте рабочее место и расставьте все стерилизованные инструменты. Перенесите резекцию опухоли на лед, чтобы сохранить жизнеспособность тканей для бактериологического исследования.

Исследуйте резекцию опухоли на предмет размера и гетерогенности. Выбирайте участки, отображающие серый цвет с мягкой или желеобразной текстурой, так как эти участки богаты опухолевыми клетками. Переложите выбранные образцы опухоли в микропробирку объемом 1,5 миллилитра или криовиальную и добавьте один миллилитр среды.

С помощью стерильных ножниц нарежьте образцы на мелкие кусочки размером от одного до двух кубических миллиметров. Затем стерильными ножницами обрежьте конец наконечника пипетки объемом 1000 микролитров, чтобы создать широкое отверстие диаметром примерно три-четыре миллиметра. Пипеткой внесите от 100 до 200 микролитров измельченных фрагментов ткани с отрезанным кончиком в лунки тарелки.

Аккуратно повторно гомогенизируйте суспензию, чтобы обеспечить равномерное распределение, так как более мелкие фрагменты имеют тенденцию быстро оседать. Поместите тарелку в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и 100% влажностью. Заменяйте среду ежедневно, если метаболическая активность опухоли вызывает быстрое пожелтение или если этого требует плотность фрагментов.

Для начала измельчите суспензию опухолевой ткани. Для приготовления замораживающей среды добавьте два миллилитра ДМСО к восьми миллилитрам среды для клеточных культур. Соедините один объем измельченной опухолевой суспензии с равным объемом приготовленной 20%-ной ДМСО замораживающей среды.

Тщательно пипеткой перебивайте смесь вверх и вниз, чтобы обеспечить тщательное смешивание. Быстро переложите криовиалы в криогенный контейнер, чтобы способствовать постепенному снижению температуры, затем инкубируйте в течение ночи при температуре минус 80 градусов Цельсия, прежде чем переложить их в жидкий азот для длительного хранения. Для размораживания снимите криоциалы с жидкого азота и сразу же поместите их на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия.

Согревайте их до тех пор, пока не оттает примерно 80% клеток. Чтобы удалить ДМСО, быстро переложите суспензию в 15-миллилитровую центрифужную пробирку, содержащую пять миллилитров предварительно подогретого 1X PBS, и центрифугируйте пробирку при 300 G в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и повторите промывку PBS с последующим центрифугированием.

Аспирируйте надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы гранула оставалась нетронутой. Повторно суспендируйте гранулу в соответствующем количестве среды и переложите ее в предварительно покрытый PDL 24-луночный планшет Laminin. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов по Цельсию.

Наблюдалось рост клеток с удлиненной, биполярной или мультиполярной морфологией из опухолевых эксплантов, прикрепленных к поверхности лунки, после минимальной продолжительности культивирования в четыре недели. Опухолевые клетки продемонстрировали сопоставимую морфологию между свежими и криоконсервированными опухолями в трех случаях, о чем свидетельствуют удлиненные и биполярные проявления, образующие сложные сети. Отчетливо наблюдалась радиальная миграция опухолевой клетки вдоль волокна.

Неудачные культуры эксплантов показали неадгезивные фрагменты и многочисленные клетки гиттера, характеризующиеся автофлуоресценцией и содержанием липидов.