Визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в брыжеечных венулах после ишемиально-реперфузионного повреждения брыжейки с помощью прижизненной микроскопии

Роль отдельных генов в возникновении и развитии тромбоза, в данном случае мы исследуем экспрессию эндотелиального PAR1 при ишемии-реперфузионном повреждении. Мы пытаемся точно определить влияние эндотелия на ответ, как после ишемии, так и во время реперфузии. Действительно важным аспектом, который до сих пор не изучен, является точное определение роли кишечных комменсалов в мезентериальной ишемии-реперфузионном повреждении.

Чтобы изучить этот вопрос, наша группа объединила прижизненную микроскопию с моделью брыжеечной ишемии-реперфузионного повреждения, а также с моделями мышей без микробов. Применение моделей тромбоза к трансгенным мышам в сочетании с прижизненной микроскопией позволяет проводить in vivo наблюдение за клеточным поведением в период возникновения заболевания. Проведение экспериментальных моделей на живых организмах всегда является сложной задачей, так как на эксперимент влияет множество факторов, включая пол, возраст, лечение анестезией, изменения правил содержания животных и так далее.

Кроме того, исследования тромбоза начались еще в прошлом веке. Многие способствующие этому факторы до сих пор не решены. Моя группа изучает роль микробиоты кишечника в тромбозе, атеросклерозе, функции тромбоцитов и васкуляризации.

Для начала расположите обезболивающую, бритую мышь в положении лежа на грелке. Подключите мышь к кислородной системе с помощью носового конуса. Закрепите конечности мыши на нагревательной подушке с помощью хирургической ленты.

Для имплантации катетера в яремную вену сделайте поперечный разрез над трахеей. Снимите кожу, покрывающую шею, и изолируйте правую яремную вену. Затем с помощью пятисантиметровой шелковой нити закройте дистальный конец вены и зафиксируйте его хирургическими щипцами.

Поместите три шелковые нити примерно на два сантиметра ниже вены, одну возле дистального конца и две возле проксимального конца яремной вены. Завяжите хирургический узел, но не закрывайте сосуд. Заполните полиэтиленовый катетер 0,9% хлорида натрия.

Удалите пузырьки воздуха и воткните его в одномиллилитровый шприц. С помощью ножниц вырежьте отверстие между вторым и третьим узлами и имплантируйте катетер в яремную вену. Аспирируйте шприц, чтобы убедиться, что кровь присутствует в катетере.

Завяжите шелковую нить, чтобы закрепить катетер в вене. Затем с помощью медицинской ленты закрепите шприц. Наполните один миллилитровый шприц акридином оранжевым в концентрации 0,5 миллиграмма на миллилитр и красителем нуклеиновой кислоты с концентрацией в пять микромоляров.

Введите 50 микролитров SYTOX Orange для внеклеточных ловушек нейтрофилов, или НВЛ. Продезинфицируйте кожу живота мыши чередующимися раундами скрабов на основе йода и спирта. Затем с помощью скальпеля выполняют трех-пятисантиметровую лапаротомию вдоль линейной белой кости.

Аккуратно выведите кишечник из брюшной полости с помощью двух смоченных в физрастворе ватных наконечников и определите место с минимальным покрытием жира. Расположите мелкие ветви кишечника на черном тесте, чтобы уменьшить фоновый сигнал. Введите 50 микролитров апельсина акридина через катетер яремной вены, чтобы визуализировать окрашенные лейкоциты.

Приобретите видео кишечника перед ишемической реперфузией. Приготовьте компресс, смоченный хлоридом натрия и поместите в него кишечник. Окклюзируйте верхнюю брыжеечную артерию небольшим сосудистым зажимом.

Аккуратно протолкните кишечник обратно в брюшную полость с помощью ватных тампонов, смоченных в физрастворе. Используйте шов 7-0, чтобы закрыть брюшную стенку и предотвратить потерю влаги и температуры. Через час снимите шов.

После ишемического периода нанесите несколько капель физраствора на стриженый участок. Затем аккуратно снимите микрососудистые зажимы с помощью аппликатора для зажимов. Используя смоченные в солевом растворе ватные кончики, аккуратно снова выведите кишечник из брюшной полости и расположите маленькие ветви вены на черном тесте.

Введите 50 микролитров апельсина акридина и запишите постишемическое видео вены. Включите высокоскоростной широкоугольный флуоресцентный микроскоп, оснащенный конденсором дальнего действия, монохроматором, объективом с 10-кратным погружением в воду и камерой устройства с зарядовой связью. Установите время экспозиции на 30 миллисекунд и выберите канал 5B с установленными фильтрами Alexa Fluor 488 и Rhodamine Red для визуализации лейкоцитов и НЭО.

Количественно оцените набор клеток в пределах области интереса 0,06 квадратного миллиметра. Затем количественно оцените адгезивные лейкоциты путем подсчета клеток, которые оставались неподвижными или прикрепленными к эндотелиальной выстилке в течение 20-секундного периода наблюдения. Определите НВЛ, меченные флуоресцентными красителями как лейкоцитами, так и нуклеиновыми кислотами.

Адгезия лейкоцитов к ишемизированному мезентериальному эндотелию увеличилась как в группах дикого типа, так и в группах F2r дельта ЭК после ишемии-реперфузионного повреждения, при этом заметно более низкая адгезия наблюдалась в группе F2r дельта ЭК, что указывает на роль эндотелиального PAR1 в рекрутировании лейкоцитов. После ишемии-реперфузионного повреждения НВЛ наблюдались только в группе дикого типа, экспрессирующей нормальные уровни PAR1 на эндотелиальных клетках, что указывает на регуляторную роль PAR1 в NETosis.