В естественных условиях Конфокальная флуоресцентная визуализация нейронной активности, вызванной сенсорной стимуляцией у частично сдерживаемых личинок данио-рерио

[Инструктор] Для начала приготовьте агро с низкой температурой плавления 3% в зародышевой среде, нагрейте агрос до температуры, безопасной для манипуляций с рыбами зебры, не причиняя вреда. До того, как агрос остынет и затвердеет, поместите личинок через два-семь дней после оплодотворения спинной стороной вверх в чашку Петри со стеклянным дном. Как только агрос застынет с личинками на месте, добавьте в блюдо пять миллилитров зародышевой среды. С помощью скальпеля разрежьте агрос по мере необходимости вокруг личинок. Перенесите чашку Петри с рыбкой данио на столик конфокального микроскопа. После акклиматизации в течение 20 минут используйте светлую визуализацию, чтобы центрировать рыбу под объективом 40-кратного погружения в воду при комнатной температуре. Установите параметры регистрации с помощью конфокального микроскопа на основе качеств и уровней экспрессии флуоресцентной молекулы, а также глубины и оптических свойств ткани. Отрегулируйте мощность лазера и настройки общего усиления, чтобы правильно улавливать флуоресцентный свет в оптимальном диапазоне и предотвратить ненужную потерю флуоресценции, зависящей от успеха G. Затем центрируйте поле зрения на нейронном кластере, расположенном в ростральной части спинного мозга. Выполните сканирование временных рядов с полем зрения 79,86 квадратных микрометров с частотой кадров 1,20 кадра в секунду и пространственным разрешением 0,119 квадратных микрометров на пиксель. Отрегулируйте поле зрения, размер и скорость сбора данных в зависимости от целей эксперимента. Через две минуты после начала визуализации добавьте в чашку 41,67 микролитра либо исходного раствора алоэ изотиоцианата, либо среды для эмбрионов и продолжайте запись в течение примерно 30 секунд, чтобы наблюдать за изменениями активности G Camp 6 в интересующей области с помощью покадровой визуализации. Если записанные выходные данные не имеют формата файла dot TIF, экспортируйте файлы изображений в виде файлов dot TIF из программного комплекса микроскопа для последующего анализа на Фиджи. Скачав программное обеспечение Fiji для анализа нейронных следов, откройте Fiji, импортируйте файлы dot CZI в программу. Используйте круг или инструменты от руки на Фиджи, чтобы выделить интересующую область или нейрон, нажав на соответствующие значки. После выбора области интереса или ROI нажмите «Анализ», «Инструменты» и «Менеджер ROI» на панели инструментов «Фиджи». Нажмите кнопку «Добавить T», чтобы добавить выбранный ROI в окно менеджера ROI. В менеджере ROI нажмите «Еще» и «Мультимера», чтобы проанализировать ROI. Оставьте настройки по умолчанию и нажмите OK, чтобы сгенерировать необработанные данные. Затем сохраните вывод в виде файла CSV для дальнейшей работы с Python или электронными таблицами. Теперь нормализуйте исходные данные, чтобы представить их в виде нейронной трассировки, усреднив последние 30 секунд двухминутного предстимула, и сгенерируйте нормализованную интенсивность флуоресценции с помощью заданной формулы и постройте нормализованные данные в виде нейронных дорожек. Введение изотиоцианата алоэ вызывало увеличение флуоресценции G CAMP 6S в локализованной области мозга личинок рыбок данио, что указывает на усиление нервной активности. При медленной скорости захвата 0,10 кадра в секунду нейроны в задней части головного и спинного мозга были хорошо видны с высоким разрешением. Увеличение скорости съемки до 0,79 кадра в секунду привело к небольшой потере пространственного разрешения, но улучшило временное разрешение. При частоте 3,16 кадра в секунду нейроны выглядели менее отчетливыми, захватывая при этом большую временную динамику.