Сборка и количественное определение сокультур, сочетающих гетеротрофные дрожжи с фототрофными сахаросекретящими цианобактериями

Наше исследование направлено на понимание микробных сетей в синтетических консорциумах, включающих секретирующие сахарозу цианобактерии и гетеротрофные грибы. В прошлом микробиологи обычно изучали чистые культуры отдельных микроорганизмов. В природе, однако, микробы обычно встречаются в консорциумах, и поэтому важно также понимать микробные сети в смешанных культурах.

Одной из основных проблем является поиск подходящих условий для роста, в том числе среды, позволяющей расти всем членам консорциума. Здесь мы в основном сосредоточены на оптимизации для максимальной продукции сахарозы и секреции фототрофным членом, который обеспечивает основу для роста гетеротрофных членов. Для отслеживания роста аксенических культур можно использовать такие распространенные методы, как измерение оптической плотности или обратного рассеяния.

Однако эти методы не применимы к кокультурам, где нам нужно количество клеток отдельного вида. В нашем протоколе мы применяем комбинацию флуоресцентного мечения и подсчета клеток, чтобы различать различных партнеров по совместной культуре. Кроме того, мы смогли показать, что подобные результаты могут быть достигнуты различными методами, начиная от простых, недорогих и заканчивая дорогостоящими, высокопроизводительными.

Для начала гранулируйте клетки цианобактерий после выращивания культуры в течение трех дней. Суспендировать гранулу в 25 миллилитрах стерильной среды CoYBG-11. Центрифугируйте образец при температуре 4 000 г в течение 20 минут при комнатной температуре.

Затем выбросьте надосадочную жидкость путем декантации. После того, как оптическая плотность определена, добавьте рассчитанное количество CoYBG-11 в 250-миллилитровую колбу с перегородкой в стерильных условиях. После этого добавьте рассчитанные объемы цианобактериальных и гетеротрофных клеточных суспензий, чтобы получить окончательный объем культуры в 50 миллилитров.

Используйте 50 микролитров из одномолярного запаса IPTG для 50-миллилитровой культуры. Затем поместите колбу в фотоинкубатор при примерно 200 микромолях фотонов на квадратный метр в секунду. Дополните окружающую среду 2% углекислым газом при 30 градусах Цельсия, сотрясением орбиты при 150 оборотах в минуту и влажностью 75%.

Для отбора проб выньте колбу из инкубатора и возьмите из культуры в стерильных условиях пробу объемом в один миллилитр. Чтобы подготовиться к микроскопическому количественному оценке, убедитесь, что счетная камера и защитное стекло не содержат пыли и клеток. Правильно расположите защитное стекло, сдвинув его на две опорные планки с небольшим давлением, избегая при этом поломки.

После того, как покровное стекло правильно расположено, обратите внимание на кольца Ньютона между двумя стеклянными поверхностями, следя за тем, чтобы покровное стекло не скользило. Теперь тщательно перемешайте клеточную суспензию и нанесите несколько микролитров на край камеры. Дайте камере полностью заполниться с помощью капиллярной силы.

Затем с помощью соответствующего объектива светового микроскопа сфокусируйтесь на линиях сетки счетной камеры. Подсчитайте ячейки в квадратах, соответствующие заданному размеру ячейки. Для количественного определения путем подсчета частиц отрегулируйте оптическую плотность образца до 0,1.

Затем добавьте 10 микролитров образца в 10 миллилитров изотонического мерного буфера. Закройте крышку чашки для образца и аккуратно перемешайте образец, слегка наклонив чашку. Поместив чашку с образцом в счетчик частиц, вставьте в чашку для образца капилляр с соответствующим размером пор для используемых клеток и закройте дверцу машины.

Начните измерение и запишите в соответствующем диапазоне. На этом этапе можно различать клетки с разными размерами клеток. Для количественного определения с помощью проточной цитометрии с помощью одноклеточной проточной цитометрии отрегулируйте оптическую плотность образцов так, чтобы они были пригодны для цитометрических измерений.

Примените приведенную формулу, чтобы убедиться, что количество клеток остается в диапазоне от 1 000 до 10 000 клеток в секунду при скорости потока 10 микролитров в минуту. Перенесите 300 микролитров суспензии каждой ячейки образца в отдельную лунку в 96-луночном планшете. Затем перенесите 96-луночный планшет на автообразец цитометра.

Открытые точечные графики и гистограммы для каналов флуоресценции и рассеяния, относящихся к образцам. Чтобы определить концентрацию клеток, запишите определенный объем образца с помощью функции записи. Разделение сигналов для фото- и гетеротрофных организмов на основе красной автофлуоресценции фототрофного организма с помощью гистограммы канала APC-H.

Затем используйте гистограмму канала FITC-H, отображающего только гетеротрофную популяцию, чтобы идентифицировать гетеротрофные клетки, содержащие зеленый флуоресцентный белок. Используйте гистограмму канала PC5.5-H, чтобы различать гетеротрофные клетки, содержащие красный флуоресцентный белок, и те, которые его не содержат.