Недорогие микрофлюидные конструкции для ламинирования полиэтилентерефталата для мультиплексной визуализации рыбок данио-рерио

Наша лаборатория заинтересована в механизмах регуляции миграции и активации нейтрофилов при повреждении тканей, инфекции и раке, уделяя особое внимание характеристикам и биологическому значению внутриклеточной передачи сигналов кальция в заживлении ран.

[Шелли] Традиционные методы микрофлюидного проектирования являются дорогостоящими и сложными, что замедляет прогресс в таких областях, как биология развития, которые требуют разнообразных сред. Мы увидели более быстрый и эффективный подход к разработке и тестированию отдельных конструкций. Таким образом, этот метод построения обеспечивает большую гибкость проектирования и пространственное разрешение по сравнению с аналогичными простыми протоколами, обеспечивая более быструю и простую итерацию по сравнению со стандартными устройствами PDMS. Используя его, мы разработали RADISH для одновременного изображения нескольких эмбрионов рыбок данио в одном поле зрения.

С помощью этого защемляющего устройства, поддерживающего визуализацию жизни с высоким разрешением, мы готовы понять, как различные сигналы, включая химические и механические стимулы, интегрируются для координации воспаления и заживления ран.

[Инструктор] Для начала разработайте шаблон для устройства с помощью выбранного программного обеспечения. В зависимости от возраста и размера эмбриона отрегулируйте ширину канала и размер центральной камеры визуализации для наилучшего прилегания. Сохраните каждый слой в виде отдельного файла изображения с идентичными размерами. Теперь инициализируйте режущий станок в соответствии с инструкциями производителя. В рабочей области дизайна выберите только что загруженные проекты. Группируйте шаблоны, предназначенные для одинаковой толщины листа ПЭТ, вместе в одном крое. Подтвердите количество и тип шаблонов в вырезе, затем выберите материал резки. Далее прикрепите лист ПЭТ к коврику для резки нужной толщины, плотно прижав для удаления пузырьков воздуха, и загрузите мат в режущую машину. Следуйте инструкциям на экране, чтобы сообщить машине для резки о начале резки. Затем снимите готовые срезы с коврика для резки. Теперь совместите слои на защитном слип-стекле либо самостоятельно, либо с предварительно вырезанными метками приводки. Закрепите слои офисным скотчем, чтобы избежать смещения во время ламинирования. В зависимости от размера устройства и емкости ламинатора устанавливайте небольшие конструкции на большую подложку с большим количеством ленты, чтобы избежать замятия или засорения подачи ламинатора. После этого включите ламинатор и заламинируйте в соответствии с инструкциями производителя. Снимите офисный скотч перед выравниванием следующего слоя. С помощью цианоакрилатного клея закрепите устройство на 35-миллиметровой тарелке, просверленной отверстием в три четверти дюйма. Затем гидроизолируйте ламинат, тщательно покрыв внешние края устройства цианоакрилатным клеем. Используйте достаточное количество клея, чтобы полностью покрыть внешние края без зазоров. Для начала вырастите эмбрионы рыбок данио рерио по крайней мере через два дня после оплодотворения в E3 или другой подходящей среде для выращивания эмбрионов. Затем обезболите эмбрионы, используя 164 миллиграмма на литр MS-222. Затем заполните чашку для хранения, содержащую установленное устройство, пятью миллилитрами Е3 или другой средой для эмбрионов, содержащей 164 миллиграмма на литр MS-222. С помощью пипетки для переноса поместите по одному обезболиваемому эмбриону в каждую камеру хранения устройства. Затем с помощью петли для волос ориентируют эмбрионы так, чтобы хвост каждого эмбриона выступал в центральную камеру визуализации, а желток обездвиживался в клиновидном канале. При желании обезопасьте головку эмбриона, добавив в камеру выдержки 1,5% агарозы с низким содержанием расплава с помощью микропипетки. Наконец, переместите устройство с эмбрионами в выбранную систему визуализации, чтобы начать визуализацию, выберите подходящую систему визуализации и цель для эксперимента. Отрегулируйте фокус образца и параметры изображения для достижения оптимального соотношения сигнал/шум и скорости захвата. Чтобы ранить эмбрион с помощью ручного пересечения, надавите лезвием скальпеля на ткань хвостового плавника на кончике хорды под стереомикроскопом. Затем верните устройство в рабочую область. Чтобы ранить эмбрион с помощью лазерной стимуляции, определите интересующую область у края складки хвостового плавника и стимулируйте в соответствии с доступной мощностью лазера. Визуализируйте эмбрион при комнатной температуре с помощью каналов GFP и RFP с интервалом кадров в одну минуту в общей сложности один час. При необходимости освободите эмбрионы после визуализации, аккуратно отсасывая возле головки с помощью пипетки для переноса или вращая чашку.