Выделение и запись микроглии гиппокампа взрослых мышей с помощью целоклеточного пластыря

Наши исследования сосредоточены на острой изоляции микроглии для записей всей клетки, включая калийные токи, чтобы понять активность ионных каналов. Протокол также может быть адаптирован для выделения микроглии в различных областях мозга, обеспечивая понимание нуля при различных неврологических состояниях.

К самым последним разработкам в области наших исследований относится использование традиционного расщепления ферментов при панкреатите в сочетании с очисткой микроглии путем сортировки флуоресцентных активных клеток. Эти достижения повысили точность и эффективность выделения конкретных популяций микроглии для дальнейшего изучения.

Наш протокол исследует электрофизиологические свойства микроглии непосредственно из гиппокампа взрослой мыши, а не полагается на первичную культивируемую КС. Такой подход позволяет проводить более точный анализ функций микроглии в их родной среде.

Наши результаты проложили путь к новым научным вопросам о биохимических и функциональных свойствах микроглии как в физиологических, так и в болезненных условиях, предлагая исследователям ценные рекомендации для дальнейшего изучения этих аспектов.

[Ведущий] Для начала положите животное под наркозом в положение лежа на препарирующем столе и приколите его конечности. Обнажите грудную клетку и перфузируйте сердце ледяным стерильным PBS для удаления внутрисосудистых циркулирующих клеток крови. Затем возьмитесь за голову и разрежьте кожу по средней линии мозга ножницами, чтобы обнажить череп. Далее разрежьте заднюю часть черепа с двух сторон и между глазницами маленькими ножницами. Разрежьте череп по сагиттальному шву и удалите череп пинцетом. После этого быстро извлеките мозговую ткань. Теперь поместите мозговую ткань в 10-сантиметровые чашки для культивирования, содержащие ледяной PBS. Рассеките кору головного мозга с обеих сторон с помощью пинцета. Изолируйте ткань гиппокампа и разрежьте ее на более мелкие кусочки. Переложите кусочки в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Затем снова суспензируйте небольшие кусочки ткани гиппокампа в двух миллилитрах ледяного сбалансированного солевого раствора Хэнкса или HBSS. И центрифугировать при 300 G в течение трех минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости добавьте 1950 микролитров смеси ферментов в 15-миллилитровую центрифужную пробирку, содержащую кусочки ткани гиппокампа. Непрерывно встряхивайте трубку центрифуги на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Далее добавьте 30 микролитров свежеприготовленной ферментной смеси два в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Пипеткой вверх и вниз 20 раз с помощью наконечника пипетки объемом в один миллилитр и выдерживайте на водяной бане в течение пяти минут при непрерывном встряхивании при температуре 37 градусов Цельсия. После извлечения центрифужной пробирки несколько раз пипетируйте суспензию вверх и вниз с помощью пипетки объемом один миллилитр, пока не останутся крупные кусочки ткани. Затем фильтруйте клеточную суспензию через 70-микрометровый фильтр клеточного фильтра и соберите фильтрат в чистую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Переложите фильтрат в новую 15-миллилитровую центрифужную пробирку и центрифугируйте при 300 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом в один миллитр. Теперь пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз 20 раз с 15 миллилитрами HBSS, чтобы промыть ее, и центрифугируйте при 300 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре магнитно-активируемого буфера для сортировки клеток. Для начала перелейте один миллилитр приготовленной одноклеточной суспензии в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте при 300 G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу одиночной клетки в 90 микролитрах магнитно-активированной сортировки клеток или в максимальном буфере. Добавьте 10 микролитров микрогранул CD11b или c и выдержите суспензию при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15 минут на горизонтальном шейкере. Затем добавьте один миллилитр максимального буфера непосредственно в тюбик, чтобы промыть одноклеточную суспензию. После центрифугирования повторно суспендируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах максимального буфера. С помощью пипетки объемом в один миллилитр перенесите повторно суспензированную суспензию клеток в сортировочную колонну в магнитном поле. Пока он остается в магнитном поле, промойте колонку трижды 500 микролитрами макс буфера. Затем снимите сортировочную колонку с магнитного поля. Добавьте в колонку один миллилитр максимального буфера и медленно протолкните его поршнем. Соберите поток наружу. Теперь засейте выбранные клетки в 24-луночный планшет, содержащий покровный лист, покрытый поли-L-лизином. Добавьте 200 микролитров питательной среды и инкубируйте в течение 20 минут в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 95% кислорода, 5% углекислого газа и влажностью от 60 до 80%. Для начала возьмем культивируемую микроглию, выделенную из мозговой ткани мышей. Найдите сферическую микроглию под водяным микроскопом с помощью объектива 40x. Далее заполните электрод внутриклеточным раствором и прикрепите его к усилительному головному столику электрофизиологической установки. Приложите положительное давление. Переключитесь на объектив 4x и найдите электрод. Затем опустите электрод в раствор для ванны. Установите усилитель в режим зажима напряжения, чтобы выполнить проверку мембраны в режиме ванны. После этого переключитесь обратно на объектив 40x и переместите наконечник электрода ближе к микроглии. Затем приложите крошечное отрицательное давление, чтобы удержать ячейку. Когда сопротивление достигнет 100 мегаОм, переключитесь из режима ванны в режим патча в мембранном тесте. Когда сопротивление достигнет 300 мегаом, сбросьте отрицательное давление. Когда сопротивление указывает на образование гигаомного уплотнения между электродом и микроглиальной мембраной. Переключитесь с патчового режима на клеточный в мембранном тесте. Затем нанесите небольшое отсасывание и инициируйте удар электрическим током, чтобы разорвать мембрану. После этого переключитесь в режим зажима напряжения, откройте программу записи и запишите токи калия в течение 200 миллисекунд.