Идентификация и количественная оценка нарушенных метаболитов у пациентов в критическом состоянии с использованием метаболомики на основе ЯМР

В нашем исследовании используется метаболомика на основе ЯМР для выявления нерегулируемых метаболитов и биохимических путей, которые изменяются у пациентов в критическом состоянии в отделении интенсивной терапии, а также мы включили пациентов с ОРДС, который является тяжелым заболеванием легких. Профилируя и сравнивая метаболические сигнатуры, мы стремимся выявить биохимические нарушения, которые связаны с прогрессированием заболевания, и подобрать методы лечения для улучшения результатов. На самом деле, мы пытаемся устранить пробел в понимании метаболической дисрегуляции у всех категорий пациентов с ОРДС, включая пациентов с легкой, умеренной и тяжелой формой ОРДС.

Для улучшения нашего понимания, для лучшего понимания заболевания, его прогрессирования, с общей целью улучшения результатов лечения пациента путем предоставления точной и персонализированной медицины. ЯМР обеспечивает простоту подготовки образцов, сохраняя целостность сыворотки для повторного анализа и обнаруживая известные и неизвестные метаболиты без химической дериватизации. Он предоставляет воспроизводимые количественные данные, обеспечивая надежное измерение метаболитов.

В отличие от таргетных подходов, ЯМР позволяет проводить чувствительное, непредвзятое исследование метаболических изменений, что делает его идеальным для обнаружения сигнатур и путей прогрессирования заболевания. Наше открытие расширит исследования ОРДС, выявив метаболические изменения на разных стадиях, которые недостаточно изучены. Используя метаболомику на основе ЯМР, мы стремимся идентифицировать нерегулируемые метаболиты и пути, что приводит к потенциальным сигнатурам для ранней диагностики, прогноза, более своевременного прогнозирования и лечения.

Этот подход способствует персонализированному управлению и углубляет знания в области метаболического профилирования с несколькими состояниями. Наши результаты проложили путь к новым научным вопросам, таким как: Как конкретные метаболиты, идентифицированные на разных стадиях ОРДС, влияют на прогрессирование заболевания? Могут ли эти нерегулируемые пути быть мишенью для ранних терапевтических вмешательств?

Кроме того, как эти метаболические изменения варьируются при других респираторных или воспалительных заболеваниях? Для начала с помощью стерильной иглы соберите два миллилитра крови из артерий пациента с диагнозом острый респираторный дистресс-синдром легкой или средней степени тяжести или ОРДС. Перелейте кровь в стерильный флакон и дайте ей свернуться в течение 30 минут при комнатной температуре.

Центрифугируйте свернувшуюся кровь в дозе 3, 100 г в течение 15 минут, чтобы отделить сыворотку. Переложите сыворотку в стерильные микроцентрифужные пробирки, сделав аликвоты объемом от 400 до 500 микролитров. Наклейте на пробирки этикетки с данными пациента и храните их при температуре 80 градусов Цельсия.

Для экспериментов с ЯМР смешайте 250 микролитров аликвоты сыворотки с 250 микролитрами буфера с солевым фосфатом, чтобы свести к минимуму колебания pH. Перемешайте смесь в течение примерно 15 секунд, чтобы обеспечить однородное перемешивание. Подготовленный образец переложить в чистую ЯМР-пробирку с коаксиальной вставкой, содержащей ТСП в концентрации 0,05 миллимоляра.

Затем поместите трубку ЯМР в магнит. Введите WRPA и выберите соответствующий номер эксперимента, чтобы настроить протонный эксперимент с импульсной программой CPMG. Нажмите на опцию «Заголовок», чтобы ввести имя пациента и другие необходимые данные.

Введите lock и нажмите Enter, чтобы заблокировать магнитное поле. Затем выберите варианты 90% воды и 10% оксида дейтерия. Затем введите ATMM и нажмите Enter, чтобы выполнить настройку и согласование пробника.

Затем в опции Acquisition Parameters выберите параметры 64 000 точек за 128 сканирований для сбора данных оптимизации. Установите задержку релаксации в пять секунд, ширину спектральной развертки в 12 ppm и время эхо-сигнала в 200 микросекунд, повторив их 300 раз. Примените уширение линии на 0,3 герца с помощью экспоненциальной оконной функции.

Далее, используя инструменты обработки и анализа ЯМР, получите спектры ЯМР. После получения окончательных спектров введите APK и ABSN для выполнения фазовой коррекции и базовой коррекции соответственно. Затем нажмите на опцию «Калибровать ось» на верхней панели и откалибруйте пик TSP до 0 ppm, автоматически или вручную.

Наконец, перенесите полученные данные из ЯМР-системы на рабочую станцию для дальнейшего анализа. После получения спектров ЯМР у пациентов с диагнозом ОРДС легкой или средней степени тяжести откройте программное обеспечение для количественного определения метаболитов ЯМР для обработки данных. Чтобы выполнить ручную коррекцию базовой линии с помощью метода Уитакера, откройте спектральный файл в процессорном модуле программного обеспечения для количественного определения метаболитов ЯМР.

Выберите коррекцию базовой линии, затем выберите метод Уитакера. Разместите точки у основания вершин во всех спектрах. После завершения сохраните спектральные файлы с базовой коррекцией в одной папке.

Затем, чтобы выполнить спектральное биннингование с помощью модуля Profiler, выберите Tools, затем Batch Process, а затем Spectral Binning. Чтобы создать окончательный лист группирования для статистического анализа, выберите папку со всеми спектральными файлами, скорректированными на базовую линию. Разделите спектры на ячейки одинакового размера с заданной шириной спектра в диапазоне от 0,01 до 0,04 частей на миллион.

Укажите размер корзины, а также начальные и конечные значения PPM. Выберите папку для сохранения выходных листов группирования. Исключите области химического сдвига, соответствующие воде и растворителю TSP, чтобы предотвратить спектральную интерференцию.

В итоговой таблице в одной строке будут отображаться названия образцов, а в других строках — значения ячеек с соответствующими PPM. Перед выполнением статистического анализа нормализуйте данные с помощью некоторой нормализации, логарифмического преобразования и масштабирования по Парето. Для многомерного анализа выполните анализ главных компонент, частичный дискриминантный анализ по методу наименьших квадратов и ортогональный дискриминантный анализ по методу наименьших квадратов, чтобы наблюдать за дискриминацией между группами, получая переменную важность проекционных оценок для каждого метаболита, ответственного за разницу в метаболическом профиле.

Выполните t-критерий Стьюдента для выявления значимых метаболитов с p-значением менее 0,05. Т-тесты позволяют построить графики с ящичковыми усами, отображающие различия в концентрациях метаболитов. Затем проведите анализ биомаркеров для создания области под графиком кривой рабочих характеристик приемника.

Выберите окончательный список значимых метаболитов на основе переменной важности проекционной оценки больше единицы, скорректированного по Бонферрони p-значения меньше 0,05 и площади под кривой больше 0,8. Используя базу данных метаболомов человека, определите метаболиты, соответствующие конкретным значениям PPM. Перед началом количественного анализа с помощью процессорного модуля откалибруйте эталонное соединение, выбранное для исследования.

Нажмите на опцию «Калибровать индикатор химического сдвига» и введите концентрацию эталонного соединения. Перетащите программный пик на спектральный опорный пик и отрегулируйте его высоту и ширину. Как только спектральные опорные пики совпадут с пиками программного обеспечения, нажмите Принять.

Далее откройте нужные спектры в модуле Профайлер и выберите подходящую библиотеку соединений для изучения. В нижней части экрана будет отображаться список метаболитов. Выберите интересующий метаболит из списка.

Нажмите на значение PPM в верхнем углу экрана. Увеличьте спектры до конкретного масштаба PPM метаболита. В этот момент на экране появляются два пика, один из которых представляет записанные данные, а другой, показанный пунктирной линией, представляет пик программного обеспечения.

Перетащите программный пик, чтобы выровнять его по записанному пику, регулируя высоту и положение в соответствии с ним. После того, как пики будут правильно выровнены, считайте концентрацию метаболита по значению, отображаемому под заголовком «Концентрация в миллимоларе». Чтобы сгенерировать выходной файл, в меню «Инструменты» нажмите на опцию «Пакетные операции» и укажите нужную папку для сохранения выходного файла.

Анализ главных компонент показал четкую кластеризацию между группами пациентов с легкой и умеренной степенью тяжести ОРДС. Ортогональный дискриминантный анализ по методу частичных наименьших квадратов выявил четкое разделение между группами с легкой и умеренной степенью ОРДС, подчеркнув метаболические различия. Т-критерий Стьюдента и анализ биомаркеров выявили ключевые нерегулируемые метаболиты между легким и умеренным ОРДС.

Лактат и изолейцин были идентифицированы как значительно нарушенные метаболиты, коррелирующие с тяжестью ОРДС.