Раскрытие гистоновых протеоформ с помощью гелевого электрофореза 2D-TAU

В настоящее время наши усилия сосредоточены на том, чтобы лучше охарактеризовать существующую корреляцию между эпигенетическими изменениями и метаболической перестройкой, с конечной целью выявления новых эпигенетических терапевтических мишеней. Учитывая динамичный и обратимый характер эпигенетической модификации, в последнее время было разработано несколько эпипрепаратов, что привело к улучшению лечения рака и снижению резистентности к химиотерапии. В последнее время значительный прогресс был достигнут в области определения характеристик экземпляров благодаря применению современной масс-спектрометрии в сочетании с методами разделения, такими как топ-пейдж или высокоэффективная жидкостная хроматография.

Основная проблема в характеризации гистонов заключается в существовании бесчисленных протеоформ гистонов, возникающих в результате перекрестных помех между динамически модифицированным ферментом и доступностью метаболитов. Начните с подготовки мини геля TAU для мини вертикального полиакриламидного геля, системы электрофореза. Для этого растворите шесть моляров мочевины в растворе 15%-ного акриламида бис-акриламида, и один миллилитр сверхчистой воды при слабом перемешивании при комнатной температуре.

Затем добавьте остальные компоненты и отрегулируйте громкость. Заполните этим раствором заранее установленные гелевые пластины, следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки воздуха, и оставив на расстоянии 1,5 сантиметра от верха. Добавьте сверху один миллилитр изопропанола, чтобы разровнять гель.

Для приготовления укладки гель растворить, растворить мочевину в 6%-ном акриламиде, бис-акриламиде с одним миллилитром сверхчистой воды. После добавления других компонентов заполните этим раствором гелевые пластины и вставьте 10-луночный гребень между пластинами, пока раствор не достигнет половины зубьев гребня. Затем растворите шесть моляров мочевины, 5% ледяную уксусную кислоту и дважды дистиллированную воду для приготовления 100 микролитров буфера для образцов TAU.

Затем растворите лиофилизированный образец гистона в 30 микролитрах буфера для образца TAU. Заполните мини-кассету рабочим буфером TAU с конечной концентрацией 5% уксусной кислоты. С помощью шприца промойте лунки геля с проточным буфером и загрузите образец в лунки с помощью микропипетки.

Затем подключите камеру электрофореза к источнику питания, расположив положительный электрод внизу. Время от времени выключайте электропитание и промывайте гелевые лунки шприцем, чтобы удалить пузырьки с нижней поверхности геля. После снятия геля с гелевых пластин разрежьте интересующую дорожку, используя чистый скальпель.

Теперь промойте гелевую дорожку 15 миллилитрами 0,5 М трис гидрохлорида, pH 8,8 в течение 15 минут. Приготовьте 15 миллилитров уравновешивающего буфера один и два, используя компоненты, показанные здесь. Затем храните уравновешивающий буфер два в темноте.

Теперь инкубируйте гелевую дорожку в 10 миллилитрах уравновешивающего буфера один с легким перемешиванием в течение 15 минут, затем сцедите. После этого инкубируйте гелевую дорожку в 10 миллилитрах уравновешивающего буфера два при слабом перемешивании в течение 15 минут в темноте перед ее сцеживанием. Затем приготовьте 15% акриламидный растворяющий гель, используя состав, показанный здесь.

Установите гелевую пластину и заполните ее раствором разрешающего геля, оставив 1,5 сантиметра от конца длинной гелевой пластины. Добавьте сверху один миллилитр изопропанола, чтобы разровнять гель и дать ему полимеризоваться. Как только гель полимеризуется, сцедите изопропанол и высушите лунку, используя трехмиллиметровую целлюлозную бумагу для хроматографии.

Вставьте разрезанную гелевую дорожку в разрешающую гелевую лунку, используя пинцет для предотвращения образования пузырьков воздуха, затем запечатайте гелевую дорожку для разрешающего геля, используя агарозу с низкой температурой плавления 0,5% в трисглицине и буфере SDS, с пятью микролитрами 0,003% бромфенолового синего. Поместите гелевые пластины в кассету и заполните их трисглицином и буфером SDS. Запустите гель при напряжении 120 вольт, пока бромфенольный синий краситель не достигнет дна.

После запуска аккуратно снимите гель с пластин и выбросьте излишки агарозы. Для начала проведите мини 2D гель тритонная кислота мочевины, или электрофорез TAU на образцах гистонов, с последующим окрашиванием серебром. Затем приготовьте показанные здесь реактивы.

С помощью чистого скальпеля вырежьте интересующие гистоновые пятна из окрашенного геля и поместите каждое пятно в свежую силиконовую пробирку объемом 1,5 миллилитра, чтобы избежать перекрестного загрязнения изоформом. Добавьте 250 микролитров 50 миллимолярного бикарбоната аммония или 50% ацетона нитро в каждое гелевое пятно и инкубируйте при слабом перемешивании в термомиксере при комнатной температуре. Сцедите раствор и повторите этот процесс три раза, пока кусочки геля не станут прозрачными.

Чтобы обезвожить гелевые пятна, добавьте 200 микролитров ацетона нитрола. На этом этапе кусочки геля станут непрозрачными белыми. Сцедите ацетон-нитрил и дайте гелевым пятнам высохнуть на воздухе в течение 10 минут.

Кусочки геля в тюбиках будут казаться сухими. Затем регидратируйте гелевые пятна, добавив 20 микролитров раствора трипсина или достаточный объем, чтобы покрыть кусочки геля. Инкубируйте пробирки в термомиксере при температуре 37 градусов Цельсия при слабом перемешивании в течение не менее четырех часов и до 16 часов.

Перенесите надосадочную жидкость, содержащую пептиды триптихов, в свежую пробирку. Добавьте к кусочкам геля 50 микролитров раствора для экстракции и дважды обработайте ультразвуком на ультразвуковой водяной бане в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую дополнительные пептиды триптихов, в ту же свежую пробирку.

Используйте лиофилизатор для сушки накопленных экстрагированных пептидов при температуре 30 градусов Цельсия. В пробирке образуется лиофилизированная гранула. Теперь добавьте 15 микролитров 0,1% трифторуксусной кислоты в каждую пробирку и аккуратно инкубируйте в термомиксере при температуре 25 градусов Цельсия.

Перенос надосадочной жидкости во флакон для жидкостной хроматографии тандема, масс-спектрометрического анализа.