Количественная оценка модуляции активности фермента эластазы с помощью колориметрического анализа

Сфера наших исследований сосредоточена на разработке природных реакционноспособных соединений. Таким образом, используя метод in vitro, мы стремимся оценить активность эластазы, фермента, участвующего в деградации эластина и потере эластичности, чтобы восстановить гомеостаз ткани. Количественная оценка натуральных растительных экстрактов сопряжена с рядом проблем, в основном связанных с их сложным химическим составом и часто сильной окраской, которая может мешать обычным измерениям.

Разработка надежных адаптивных протоколов жизненно важна для развития этой области исследований. Наше исследование предлагает несколько преимуществ для этой области, включая простоту, чувствительность, быстрый результат напряжения и адаптируемость к различным исследовательским потребностям. Для начала взвесьте необходимое количество основания Tris с помощью аналитических весов и перенесите взвешенное основание Tris в стакан.

С помощью мерного цилиндра добавьте в стакан деионизированную воду. Размешайте раствор магнитной мешалкой до полного растворения основы Триса. Затем отрегулируйте pH раствора до восьми с помощью четырех обычных соляных кислот.

Как только желаемый pH будет достигнут, переложите раствор в мерную колбу. С помощью деионизированной воды заполните колбу до отмеченного объема. Переложите подготовленный буфер в бутылку для хранения с маркировкой и храните при комнатной температуре.

Для подготовки образца необходимо точно взвесить необходимое количество образца с помощью аналитических весов. Растворите образец в подготовленном реакционном буфере для достижения нужной концентрации. Используйте вихревой смеситель для полного растворения образца.

И храните подготовленный образец на льду. Далее готовят рабочий раствор фермента эластазы в реакционном буфере до конечной концентрации 10 мкг на миллилитр. Храните раствор эластазы на льду до готовности к применению.

Теперь приготовьте 0,8 миллимолярный раствор SANA в реакционном буфере. Берегите раствор от света и храните его при температуре четыре градуса Цельсия до использования. Для фенилметансульфонилфторида, или материала PMSF, готовят 100 миллимолярный раствор PMSF в изопропаноле.

Храните приготовленный раствор на льду. Готовьте все реакции в трех экземплярах с помощью микроцентрифужных пробирок. Инкубируйте все пробирки при комнатной температуре в течение 20 минут.

Затем добавьте по 100 микролитров раствора подложки SANA в каждую пробирку, за исключением регуляторов цвета. Аккуратно переверните пробирки несколько раз, чтобы перемешать образцы и переложите 300 микролитров из каждой пробирки на 96-луночный планшет, обеспечивая тройные измерения для каждого образца. Наконец, поместите 96-луночный планшет в считыватель микропланшетов, настроенный на 410 нанометров, и измеряйте поглощение периодически, каждую минуту в течение 20 минут, или пока сигнал не стабилизируется при комнатной температуре.

Экстракт 1 показал слабую, но значительную ингибиторную активность эластазы в концентрациях 1, 0,75 и 0,5 мг на миллилитр, без существенного эффекта при 0,25 мг на миллилитр. Второй экстракт продемонстрировал высокую ингибиторную активность эластазы при всех испытуемых концентрациях, при этом уровни ингибирования были аналогичны положительному контролю при 1, 0,75 и 0,5 мг на миллилитр.