Прижизненная продольная визуализация сосудистой динамики в кальвариальном костном мозге

Данное исследование направлено на понимание сосудистой динамики в макроокружении костного мозга с помощью прижизненной микроскопии с целью выявления реакции кровеносных сосудов на нормальное и патологическое кроветворение. Мы используем передовые технологии визуализации, такие как фотомикроскопия, трансгенные модели животных, а также анализируем индикатор для визуализации и количественной оценки динамических сосудистых изменений в живых тканях с течением времени. Ключевым достижением является усовершенствование нашего протокола для улучшения благополучия животных и приведения его в соответствие с тремя R. Наш лонгитюдный подход сводит к минимуму хирургические этапы и значительно сокращает количество животных, необходимых для нашего исследования.

Наш протокол удовлетворяет потребность в нетоксичной, долгосрочной прижизненной визуализации с помощью двухфотонного микроскопа, который позволяет глубоко проникать в ткани и визуализировать поведение и взаимодействие клеток с высоким разрешением. Использование напечатанного на 3D-принтере головного имплантата позволит очень легко найти интересующую область во время сеанса продольной визуализации без необходимости изменения высоты, угла или порядка. В настоящее время мы используем этот протокол для отслеживания конкретных подтипов эндотелия и их реакции на развитие лейкемии и медикаментозное лечение, чтобы лучше понять их вклад в патогенез заболевания.

Для начала запустите программное обеспечение для сегментации и импортируйте файлы микро-КТ DICOM, чтобы изолировать череп. Выполните сегментацию на основе пороговых значений, чтобы отделить костную ткань от окружающих структур. Вручную настраивайте сложные или зашумленные области для уточнения сегментации.

В 3D Slicer импортируйте файлы DICOM и загрузите набор данных. Наблюдайте за срезами КТ в проекциях аксиального, сагиттального и коронального среза. Откройте редактор сегментов и нажмите кнопку Добавить, чтобы создать новую сегментацию, а затем нажмите кнопку Добавить еще раз, чтобы создать новый сегмент для пороговых значений.

В панели редактора сегментов нажмите на эффект порога. Отрегулируйте ползунки нижнего и верхнего порога или введите числовые значения, чтобы выделить сегментированную область красным цветом. Чтобы экспортировать сегментированный череп в виде файла stl, переключитесь на модуль сегментации.

Убедитесь, что выбран сегмент с пороговым значением. В разделе экспорта/импорта моделей и карт надписей установите тип экспорта на модели и формат файла на stl, затем нажмите кнопку экспорт, чтобы сохранить файл. Для подготовки модели черепа в САПР сначала импортируйте упрощенную модель черепа в формате stl в программное обеспечение САПР в качестве новой детали или модели.

В срединной плоскости создайте ось, касательную к кальварии, затем сохраните подготовленную модель черепа. Создайте эскиз в плоскости голвары и спроектируйте сплайн в форме груши от AP плюс 6,5 до минус два. При ширине шести миллиметров при AP 0.0 это будет наблюдаемый контур поверхности.

Спроектируйте хвост имплантата таким образом, чтобы он соответствовал структуре черепа для правильной фиксации при сохранении доступного объема. Наконец, создайте защитный чехол для защиты смотрового окна, когда оно не используется. Поместите мышь под наркозом на грелку, установленную на 37 градусов по Цельсию, и визуально контролируйте частоту дыхания.

Побрейте голову мыши электрической бритвой. Затем нанесите каплю офтальмологического геля на глаза мыши. Убедитесь, что все волосы удалены, чтобы предотвратить появление артефактов изображения и снизить риск инфицирования раны.

Теперь с помощью стерильных щипцов и ножниц сделайте небольшой разрез в центральной части кожи головы, чтобы обнажить центральный костный рубец. Удалите соединительную ткань между черепом и кожей головы. Смешайте достаточное количество стоматологического цемента в чашке Петри, чтобы получилась паста.

Быстро нанесите его на нижнюю часть фиксирующей головки имплантата. Не допуская попадания стоматологического цемента в область визуализации, поместите держатель головы на открытый череп и дайте ему застыть. Включите поток изофлурана в направлении стереотаксической маски микроскопа.

Теперь быстро поднесите мышь к микроскопу. Осторожно вставьте зубы мыши в маску, чтобы обеспечить правильное проникновение изофлурана, подняв ее нос одной рукой. Держа мышь одной рукой, другой рукой аккуратно вставьте ласточкин хвост имплантата фиксации головки в держатель фиксации.

Закрепите его, сделав пол-оборота винтовой ручки. Затем введите ректальный зонд, предварительно встроенный в гель на водной основе, для контроля температуры мыши. Заполните камеру визуализации головы большим количеством геля на водной основе, или PBS.

Опустите погружной объектив до полного погружения для оптимального возбуждения и обнаружения сигнала во время двухфотонного возбуждения. Переместите ступень X, Y и Z-привод, чтобы сфокусироваться на центральной кости в рубце каркаса. Определите ткани, отмеченные костной поверхностью и центральной веной.

Выключите свет в комнате и закройте коробку вокруг подставки для микроскопа. После активации детекторов без ТОСКАН. Установите PMT1 для обнаружения второго ГСП на 423–461 нанометрах, высокий D2 для GFP на 485–548 нанометрах и высокий D3 для TD D'Amato на 551–645 нанометрах.

Оставьте смещение равным нулю. Теперь установите коэффициент усиления ФЭУ SHG на 850 вольт и высокий коэффициент усиления D на 100%. Увеличивайте мощность инфракрасного лазера до тех пор, пока изображение с динамическим диапазоном 200 уровней серого не станет видимым на самом низком из трех каналов. В программном обеспечении для сбора данных область локатора, содержащая карманы костного мозга, указывается заключенной в поверхность кости.

Чтобы определить различные области интереса или ROI, активируйте Loss Navigator и создайте обзор в спиральном режиме. Нажмите на значок одного изображения, чтобы записать выбранные позиции ROI и переименовать каждую позицию в списке задач. Чтобы получить объем стека Z, выберите режим стека Z и определите размер шага с точностью до трех микрометров.

Отмените выбор параметра «Одинаковый размер стека для всех регионов», затем нажмите «Начало» для начала и «От конца» до «Финиша». После захвата нажмите кнопку «Переопределить стек». Нажмите «Старт», чтобы начать сбор изображений, и сохраните изображения в соответствующей папке.

Чтобы измерить динамическую характеристику, такую как проницаемость сосудов, измените режим сбора данных на XYZT, чтобы получить интервальную съемку. В модуле T настройте временной интервал до трех минут и продолжительность до одного часа. Теперь введите 100 микролитров 70-килодальтонного декстрана ТРИТК внутривенно в концентрации 4 миллиграмма на миллилитр и начните сбор.

После переноса мыши на операционную метку на грелке при температуре 37 градусов Цельсия нанесите на череп гель для поддержания его увлажнения. Закройте область визуализации головного имплантата специальной крышкой и тщательно закрепите крышку винтом. Поместите мышь в нагревательную коробку, установленную на 37 градусов по Цельсию, и подождите, пока она проснется.

Как только мышь полностью восстановится, перевезите ее в помещение для животных и поместите в чистую клетку с гидрогелем и обогащением окружающей среды. Для продольных приобретений поместите небольшую каплю офтальмологического геля на глаза мыши с уже установленным держателем для головы. Получите обзорное изображение, как показано ранее.

При необходимости повторно выровняйте предыдущее и новое изображения с помощью модуля загрузки и выравнивания изображений. Откройте изображение для захвата экрана, чтобы отметить положения на исходном месте. CAD-модель титанового имплантата фиксации головы была разработана в соответствии с анатомическим строением черепа, обеспечивая стабильное крепление к предметному столику микроскопа для визуализации на клеточном уровне.

Имплантат был успешно прикреплен к черепу мыши и обеспечил стабильную визуализацию в течение долгого времени, позволяя мыши поддерживать нормальную деятельность. Сосудистая сеть костного мозга была визуализирована с помощью сканирования плитки, что выявило сложную сеть артериол, переходных капилляров и синусоид. Количественный анализ сосудов показал сегментацию сосудистых структур, позволяющую измерить диаметр, длину и прямолинейность сосудов и их корреляцию.

Продольная визуализация зафиксировала прогрессирующее ремоделирование сосудистой сети кальварии во время прогрессирования лейкемии с увеличением плотности сосудов, наблюдаемым с течением времени. Сосудистую проницаемость оценивали динамически, показывая дифференциальное удержание флуоресцентного красителя с течением времени, демонстрируя дифференциальную проницаемость различных сосудов костного мозга.