Измерение ферментативной активности деубиквитилирующих ферментов, связанных с нарушением развития нервной системы, с помощью анализа расщепления убиквитиновой цепи in vitro

Мы заинтересованы в определении молекулярной основы нарушений развития нервной системы, связанных с вариантами генов в ферментах убиквитиновой системы. Мы используем передовые методы для анализа сигнальных путей, контролируемых этими ферментами, и для определения влияния вариантов генов на биологию белка. Преимущество этого метода заключается в том, что это метод, не зависящий от субстрата, который не требует предварительных знаний о субстратах, регулируемых конкретным DUB.

Таким образом, мы можем напрямую измерить влияние вариации генов, связанных с расстройством развития нервной системы, на каталитическую активность DUB и предположить возможные патогенные механизмы. Поскольку клеточные функции большинства DUB плохо изучены, наша лаборатория сосредоточится на выявлении сигнальных путей, которые опосредуют эти ферменты, и на том, как варианты генов, связанные с генетическими заболеваниями, влияют на эти процессы. Для начала разморозьте 20 микролитров химически компетентных клеток Rosetta 2 Escherichia coli на льду непосредственно перед применением.

Добавьте от одного до 10 нанограммов экспрессирующей плазмиды pGEX6P1 USP27X и инкубируйте в течение пяти минут на льду. Подвергнуть клетки тепловому удару в течение 30 секунд при температуре 42 градуса Цельсия в сухой ванне. Затем инкубируйте клетки на льду в течение двух минут.

Добавьте в ячейки 80 микролитров среды SOC комнатной температуры. Инкубируйте в течение 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия со скоростью вращения 200 об/мин в 19-миллиметровом орбитальном настольном вибростенде с регулируемой температурой. Затем насыпьте 50 микролитров культуры на агаровую пластину LB, дополненную левомицетином и ампициллином.

Инкубируйте в течение 20 часов при температуре 37 градусов Цельсия крышкой вниз в инкубаторе с регулируемой температурой. Выберите одну колонию трансформированных бактерий и добавьте ее в 10 миллилитров стерильной LB-среды с добавлением хлорамфеникола и ампициллина. Инкубируйте в течение 20 часов, как показано ранее.

Затем добавьте 10 миллилитров ночной культуры к одному литру туберкулезной среды, дополненной левомицетином и ампициллином. Инкубируйте до тех пор, пока оптическая плотность на 600 нанометрах не достигнет 0,5-0,6. Затем добавьте в культуру 50-микромолярный изопропилбета-d-1-тиогалактопиранозид для индуцирования экспрессии.

После охлаждения образца до 16 градусов Цельсия инкубировать в течение 20 часов при температуре 16 градусов Цельсия при вращении 200 об/мин. Затем центрифугируйте клетки в течение 20 минут при температуре 3000 G или выше при четырех градусах Цельсия, чтобы получить гранулы из культуры экспрессии. Наконец, храните гранулы при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее одного часа.

Для начала закрепите пустую колонну самотека в ретортной стойке. Заполните колонку двумя-тремя миллилитрами глутатион-агарозной смолы, чтобы очистить клеточную гранулу, собранную из одного литра культуры экспрессии. Промыть колонну одним слоем смолы объемом 20% этанола.

После промывки колонки разморозьте ячейку в гранулах при температуре четыре градуса Цельсия. Добавьте 30 миллилитров буфера MS500 в размороженную гранулу и инкубируйте с мягким вращением из конца в конец. Теперь обработайте лизированные клетки ультразвуком в 50-миллилитровой центрифужной пробирке на льду до тех пор, пока лизат не будет свободно течь при дозировании из наконечника пипетки.

Центрифугируйте в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и 20 000 G или выше, чтобы удалить надосадочную жидкость. Затем сцедите надосадочную жидкость в стакан и загрузите очищенный лизат в колонку. Пропустите лизат через колонну под действием силы тяжести, собирая проточный поток.

После этого промойте колонку не менее чем двумя объемами смоляного слоя промывочного буфера MS500 и соберите промывочный поток в пяти миллилитровых фракциях. Затем добавьте по одному микролитру каждой фракции в 100 микролитров реагента Брэдфорда, чтобы проверить наличие белка. Восстановите белок, пропустив неуловимый буфер MS500 через колонку и собрав пять миллилитровых фракций элюирования.

Чтобы осадить белок, добавьте в элюат два объема четырехмолярного сульфата аммония и аккуратно переверните трубку, пока она не помутнеет. Центрифугируйте в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и 20 000 G или выше. Удаляйте надосадочную жидкость после каждого центрифугирования, не нарушая белковую гранулу.

Затем повторно растворите белок в буфере MS500 с добавлением 25% глицерина перед его хранением. Приготовьте 10 микролитров очищенного USP27X с маркировкой GST, в буфере для активации деубиквитилированного фермента для каждой временной точки для каждого деубиквитилированного фермента. Перед добавлением убиквитиновых цепочек добавьте семь микролитров загрузочного буфера SDS-PAGE в образец с нулевым временем, чтобы предотвратить начало реакции деубиквитилирования.

В каждую временную точку для каждого деубиквитилирующего фермента добавьте 375 нанограммов K63-связанных диубиквитиновых цепей, разведенных в 10 микролитрах буфера активации фермента. Инкубируйте пробирки при температуре 30 градусов Цельсия, останавливая каждый момент времени, добавляя семь микролитров буфера загрузки SDS-PAGE. Выполните SDS-PAGE, используя градиентный гель от 4 до 12%.

Дикий тип USP27X расщепляет K63-связанные ди-убиквитины цепи на моно-убиквитин после одного часа инкубации. Ассоциированные с XLID-105 вариации F313V, Y381H и S404N не расщепляли K63-связанные диубиквитиновые цепи после одного часа инкубации.