Мышиная модель геморрагической трансформации, индуцированной острой гипергликемией в сочетании с транзиторной фокальной ишемией

В настоящем исследовании мы стремимся предоставить всеобъемлющий и подробный протокол для создания высоковоспроизводимой животной модели радикальной трансформации человека с использованием реперфузии окклюзии средней мозговой артерии у мышей C57BL/6 с острой гипергликемией.

По сравнению с другими методиками, наш протокол демонстрирует хорошую повторяемость, высокую стабильность и низкую смертность животных, что делает его пригодным для широкого использования в доклинических исследованиях геморрагической трансформации.

В будущем мы сосредоточимся на исследовании влияния геморрагической трансформации на неврологические заболевания и изучении лежащего в ее основе механизма.

[Инструктор] Для начала протрите операционную платформу и окружающую рабочую зону 75% этанолом. Включите выключатель отопления и установите температуру на 37 градусов по Цельсию. Переместите мышь под наркозом на операционную платформу в положении лежа на спине и закрепите ее конечности с помощью клейкой ленты. Затем, за 15 минут до хирургической процедуры, внутрибрюшинно введите мышам 30% глюкозу или физиологический раствор. С помощью скальпеля сделайте горизонтальный разрез с отверстием в 1,5 сантиметра по средней линии шеи. Выполните тупое рассечение в области перевернутого треугольника, чтобы определить и отделить левую общую сонную артерию. С помощью офтальмологических щипцов рассеките блуждающий нерв, прилегающий к общей сонной артерии, и слизистую ткань, окружающую кровеносные сосуды. С помощью рассасывающегося шва 5-0 полигликолевой кислоты сделайте кольцевание на общей сонной артерии, сохраняя шов ненатянутым. Затем отделите вверх вдоль общей сонной артерии. Теперь разделите бифуркацию, чтобы полностью обнажить наружную и внутреннюю сонную артерию. Завяжите петлю и плотно завяжите рассасывающийся шов 5-0 полигликолевой кислоты вокруг наружной сонной артерии дистальнее разветвления. Затем, используя два легких микрозубчатых зажима артериальной артерии, временно зажмите общую сонную артерию и внутреннюю сонную артерию, чтобы блокировать кровоток. Затем натяните завязку из шва на дистальном отделе наружной сонной артерии и общей сонной артерии, чтобы выпрямить сегмент наружной сонной артерии. Теперь с помощью микроножниц сделайте небольшой разрез между двумя шовными завязками на наружной сонной артерии. Вставьте 30-миллиметровый шов из моноволокна с силиконовым покрытием в наружную сонную артерию. Завяжите петлю и слегка завяжите второй рассасывающийся шов 5-0 полигликолевой кислоты на наружной сонной артерии рядом с бифуркацией, чтобы предотвратить отступление монофиламентного шва. Затем полностью перережьте наружную сонную артерию дистальнее постоянной перевязки, и удалите зажим щипцов артерии из внутренней сонной артерии. Далее отводите шов к раздвоению общей сонной артерии. Осторожно втяните и поверните культю наружной сонной артерии. Отрегулируйте направление наложения шва и введите его на расстоянии от 9 до 10 миллиметров от разветвления общей сонной артерии во внутреннюю сонную артерию, чтобы заблокировать среднюю мозговую артерию. Затем затяните второй рассасывающийся полигликолевый кислотный шов вокруг наружной сонной артерии и снимите зажим артерии с общей сонной артерии. После повторного обезболивания мыши, с помощью микрозажима артерии, пережмите общую сонную артерию. Частично втяните монофиламент из внутренней сонной артерии до тех пор, пока кончик, покрытый силиконом, не станет видимым через внутреннюю сонную артерию. Затем поместите еще один зажим артерии микроклипса на внутреннюю сонную артерию над наконечником, покрытым силиконом. Полностью извлеките монофиламент и плотно прилегайте к культе наружной сонной артерии. Наконец, снимите зажим микроклипсы артерии с внутренней сонной артерии и общей сонной артерии соответственно. Для начала протрите хвост мыши ватным тампоном, смоченным в спирте, чтобы сделать хвостовую жилу полностью гиперемированной. С помощью хирургических ножниц отрежьте кончик хвоста на один-два миллиметра. Аккуратно сожмите вдоль корня хвоста до кончика, чтобы облегчить отток крови из разреза. Затем расположите резервуар для абсорбции образца тестовой бумаги на краю капли крови. Считайте показания глюкометра и запишите результат. Для измерения мозгового кровотока держите наконечник лазерного допплеровского флоумеметрического зонда перпендикулярно поверхности левого теменного черепа до тех пор, пока не будет считан стабильный поток, и запишите это значение. После удаления мозга усыпленной мыши MCAO поместите мозговую ткань в матрицу мозга грызуна и разрежьте ее на двухмиллиметровые корональные срезы. Переложите ломтики в 24-луночную тарелку и инкубируйте их с 2% раствором 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. После этого отрежьте срезы ткани от 24-луночного планшета изогнутыми щипцами и расположите их на стеклянной сканирующей пластине. Окрашивайте неподвижный срез мозга раствором гематоксилина в течение трех минут. Дифференцируйте его, погрузив ломтик в 5% спирт соляной кислоты на пять секунд. Затем обезвоживайте и гиалинизируйте срез с помощью градиентных растворов этанола и ксилола. Смонтируйте секцию с помощью нейтральных смол. Через 23 часа после MCAO введите 2% раствор Evans Blue мышке и извлеките мозг. После гомогенизации и центрифугирования ткани переложите надосадочную жидкость в другую центрифужную пробирку и разбавьте ее этанолом в четыре раза. Измерьте поглощение надосадочной жидкости на 620 нанометрах с помощью спектрофотометра. Введите FITC-декстран в хвостовую вену через 24 часа после MCAO и дайте ему циркулировать в крови в течение 10 минут. После фиксации мозговой ткани вживите мозговую ткань с помощью состава, обеспечивающего оптимальную температуру резки, и разрежьте ее на участки толщиной 30 микрометров. Перенесите срезы на предметное стекло микроскопа с помощью инокуляционной петли, убедившись, что они прилипают к поверхности предметного стекла. Смонтируйте участки ткани мозга с помощью монтажной среды, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Уровень глюкозы в крови значительно повышался после MCAO у мышей, которым вводили глюкозу, по сравнению с группами, получавшими физиологический раствор. Видимого инфаркта на срезах мозга в группе симуляции с физиологическим раствором или симуляции с глюкозой не наблюдалось. В группе MCAO с глюкозой наблюдался значительно больший объем инфаркта головного мозга по сравнению с группой MCAO с солевым раствором. В ишемизированном полушарии МКАО в группе глюкозы наблюдались множественные точечные кровоизлияния, которые отсутствовали в остальных группах. Значительная инфильтрация клеток крови отмечена в инфарктных областях коры и стриатума в группе MCAO с глюкозой. Проницаемость по синему цвету Эванса и утечка FITC-декстрана были заметно выше в группе MCAO с глюкозой по сравнению с MCAO в группе с солевым раствором.