Анализ сфероидной инвазии сфероидов между макрофагами и опухолями

Мы хотим исследовать взаимодействие раковых и иммунных клеток, чтобы лучше понять, как они взаимодействуют во время метастазирования. В большинстве случаев модели in vivo являются обычным способом решения исследовательских вопросов, касающихся 3D-инвазии раковых клеток в контексте иммунной системы, или в центре внимания находятся изолированные компоненты системы. Метод, позволяющий анализировать поведение клеток, который имитирует сложность ситуации in vivo, но позволяет более непосредственно манипулировать конкретными характеристиками окружающей среды под микроскопом.

Мы демонстрируем, что неизмененные раковые клетки уменьшают инвазию в 3D-матрице коллагена I при их совместном культивировании с макрофагами, которые были истощены для моторного белка KIF16B. Это указывает на роль KIF16B рециркуляции поверхностных белков макрофагов в микроокружении опухоли. Мы хотели бы продолжить совершенствовать наш метод таким образом, чтобы он позволял визуализировать деградацию матрицы на границе макрофагальных раковых клеток, тем самым получая лучшее понимание деградационных и адгезивных механизмов.

Для начала культивируйте клетки H1299 GFP в среде раковых клеток в колбе для клеточных культур площадью 25 квадратных сантиметров при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа до тех пор, пока они не достигнут 80% конфлюенции. Промойте клетки один раз с помощью DPBS и добавьте один миллилитр Trypsin-EDTA в течение двух-трех минут, пока клетки не отделятся. Остановите ферментативную реакцию, добавив два миллилитра раковых клеточных сред.

Далее центрифугируйте отделенную клеточную суспензию в 15-миллилитровой пробирке при 245 G в течение пяти минут. Надосадочную жидкость, содержащую раствор трипсина, перед промыванием гранулы следует удалить пятью миллилитрами DPBS. После центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах среды раковых клеток.

Подсчитайте ячейки с помощью камеры Нейбауэра. Перенесите 8 000 клеток в 96-луночный планшет со сверхнизкой адгезией в окончательном объеме 25 микролитров среды раковых клеток. Инкубируйте клетки в течение трех дней при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе.

Через трое суток проверьте сфероиды под микроскопом на однородность. После сбора образца крови человека переложите 20 миллилитров крови из мешка для переливания в 50-миллилитровую реакционную пробирку. Добавьте 15 миллилитров среды для разделения лимфоцитов в новую 50-миллилитровую пробирку.

Осторожно перенесите 20 миллилитров крови в пробирку, содержащую среду для разделения лимфоцитов, не перемешивая, и центрифугируйте смесь при 450 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Во время центрифугирования добавьте 10 миллилитров холодного RPMI 1640 Medium в новую 50-миллилитровую пробирку. После центрифугирования переложите плотную белую фазу из содержащей кровь пробирки в подготовленную пробирку, содержащую РПМИ, и заполните ее до 50 миллилитров холодным РПМИ.

Центрифугируйте суспензию при 450 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах холодной RPMI и заполните ее до 50 миллилитров с помощью RPMI 1640. Снова центрифугируйте смесь и повторно суспендируйте гранулу в 50 миллилитрах RPMI.

Снова центрифугируйте образец и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1,5 миллилитрах холодного моноцитарного буфера. Далее добавьте в клеточную суспензию 250 микролитров анти-CD14 MicroBeads, и инкубируйте в течение 15 минут на льду. Во время инкубации подготовьте разделительную колонну, прикрепив фильтр к магнитному сепаратору.

Добавьте в колонку 900 микролитров моноцитарного буфера для уравновешивания. После инкубации вылейте клеточную суспензию на фильтр и дайте ей протекать под действием силы тяжести в пробирку для отходов. Добавьте один миллилитр моноцитарного буфера, чтобы промыть колонку, содержащую клетки, связанные магнитными шариками.

Замените пробирку для отходов под колонной на свежую 50-миллилитровую трубку, содержащую 20 миллилитров RPMI. Добавьте в колонку три миллилитра моноцитарного буфера. Снимите колонку с магнитной стойки и прикрепите штамп.

Вдавите ячейки в подготовленную 50 миллилитровую пробирку и заполните ее до 30 миллилитров с помощью RPMI. Подсчитайте клетки с помощью счетной камеры Нейбауэра под световым микроскопом, а количество клеток отрегулируйте до двух умножить на 10 в степени шести клеток на миллилитр с помощью RPMI. Засейте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую лунку шестилуночной камеры и инкубируйте в течение двух-четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

После инкубации проверьте, правильно ли прилипли клетки, и замените RPMI на 1,5 миллилитра моносреды. Продолжайте инкубацию до шести дней, пока моноциты не дифференцируются в макрофаги. После получения первичных макрофагов человека из образцов крови донора в шестилуночном планшете добавьте 500 микролитров аккутазы и инкубируйте в течение 40 минут, чтобы отделить макрофаги.

Затем добавьте 500 микролитров среды и переложите в 15-миллилитровую центрифужную пробирку для центрифугирования. Затем один раз промойте клетки двумя миллилитрами DPBS и подсчитайте их с помощью камеры Нейбауэра. Разведите нужное количество макрофагов в 40 микролитрах коллагена, смешиваю, и кратковременно закручиваю трубку.

Чтобы промыть сфероиды, добавьте 300 микролитров DPBS в лунки 96-луночной пластины. Используйте один миллилитр синего наконечника для пипетки с отрезанным концом для сбора стероида с DPBS. После того, как стероид осядет на кончике, кратковременно прижмите пипетку к нижней части камеры визуализации, чтобы перенести опухолевый стероид за счет поверхностного натяжения.

Удалите как можно больше остатков DPBS, перенесенных со стероидом. Быстро добавьте 40 микролитров смеси макрофагов коллагена I в камеру визуализации, содержащую стероиды. Инкубируйте планшет в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа во влажных условиях, чтобы полностью полимеризовать коллагеновую смесь.

После полимеризации осторожно добавьте в каждую лунку по 25 микролитров раковых клеточных сред, и продолжайте инкубацию в течение трех дней. Визуализируйте живой образец с помощью лазерного сканирующего микроскопа в желаемые моменты времени. Площадь сфероида H1299 GFP составила 40 307 квадратных метров на третий день вторжения, в то время как периметр сфероида составил 1700,17 микрометров, что указывает на рост с течением времени.

Наблюдалась коллективная инвазия раковых клеток из сфероида. Была идентифицирована 51 изолированная частица, служащая индикатором для индивидуальной инвазии раковых клеток. Сфероид сохранял отношение сторон 1,10 и круговость 0,18, демонстрируя низкую деформацию.