Эффективный нокдаун генов в печени с помощью интраспленочной инъекции малой РНК, доставляемой аденоассоциированным вирусом серотипа 8 (AAV8)
1 ноября 2024 г.
Этот протокол описывает, как интраспленочная инъекция малой РНК, доставляемой AAV8, достигает такой же эффективности нокдауна гена в печени, как и инъекция в воротную вену, представляя собой более простую процедуру с гораздо более низкой периоперационной и послеоперационной смертностью и осложнениями.
Наша исследовательская деятельность направлена на улучшение понимания прогрессирования сложных расстройств с помощью вычислительных и экспериментальных методов. Мы сосредоточены на разработке стратегии, позволяющей замедлить или обратить вспять прогрессирование сложных заболеваний, таких как метаболические нарушения, старение и рак. Ключевой вопрос, на который мы пытаемся ответить, заключается в том, почему некоторые предраковые поражения перерастают в рак, почему некоторые ткани взрослого человека могут восстанавливаться после травмы и что стимулирует процесс старения. Эти технологии включают в себя секвенирование всего генома, секвенирование отдельных клеток, надежный алгоритм вычислений и машинного обучения, моделирование на основе искусственного интеллекта и экспериментальные модели животных, которые имеют отношение к заболеваниям человека. Этот протокол описывает метод In-Vivo Gene Knockdown с использованием интраспленочных инъекций AAV8, доставляемых короткой шпилькой РНК-конструкции, нацеленной на ядерный стемминг. Ядерный ствол — это фактор самообновления стволовых клеток, который играет важную роль в эмбриональном развитии, развитии рака и регенерации тканей взрослого человека. Мы показали, что при трансплантации инъекции AAV8 доставляют короткую шпильку РНК, достигая такой же эффективности нокдауна. Набор инъекций AAV8 в воротную вену обеспечивает конструкцию, но это связано с гораздо меньшими осложнениями и процедурой намного проще.
[Инструктор] Для начала перенесите мышей под наркозом в асептическую операционную зону в правостороннем лежачем положении. С помощью хирургического лезвия сделайте 15-миллиметровый разрез на левой верхней брюшной стенке, а затем 10-миллиметровый разрез на брюшине. С помощью щипцов аккуратно обнажите селезенку и подложите под нее кусок влажной марли, чтобы удержать ее на месте. Затем с помощью иглы 30 калибра введите 50 микролитров вирусов AAV8 в селезенку на глубине трех миллиметров ниже поверхности в течение 30 секунд. Затем накройте участок ватным тампоном и сожмите его в течение одной минуты. После этого зашить брюшную стенку с помощью рассасывающегося шва 4-0. Затем закройте кожу нерассасывающимся швом 4-0. После обезболивания мыши проводят лапаротомию, делая разрез по средней линии на коже, а затем в брюшину. Положите на левую сторону мыши стерильную марлевую салфетку, смоченную в стерильном физрастворе. С помощью стерильного ватного тампона аккуратно вытащите толстый и тонкий кишечник. Поместите кишки поверх влажной марлевой салфетки и накройте их, чтобы предотвратить высыхание или контакт с кожей. Затем с помощью стерильной иглы 32 калибра введите 50 микролитров вируса AAV8 в воротную вену под углом менее пяти градусов. Введите иглу на три-пять миллиметров в воротную вену и дайте крови течь мимо иглы в течение пяти секунд, чтобы предотвратить обратный поток. Далее положите стерильный ватный тампон на место инъекции и слегка надавливайте до тех пор, пока вена полностью не закроется и не произойдет кровотечения. После этого аккуратно верните внутренние органы обратно в брюшную полость. Затем закройте брюшную стенку рассасывающимся швом 4-0, а кожу — нерассасывающимся швом 4-0. Интрасселезеночные инъекции и инъекции в воротную вену показали статистически эквивалентную сниженную эффективность мРНК без существенных различий между двумя методами.
Обзор
В данном протоколе описывается метод нокдауна генов in-vivo с использованием внутриселезеночных инъекций коротких шпилечных РНК, доставленных с помощью AAV8. Этот подход позволяет достичь эффективности нокдауна генов в печени, аналогичной при инъекциях в воротную вену, при этом он проще в исполнении и связан с меньшим количеством осложнений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генная терапия
- Нейробиология
- Регенеративная медицина
Теоретические основы
- Понимание методов нокдауна генов имеет решающее значение для изучения сложных заболеваний.
- AAV8 представляет собой вирусный вектор, используемый для доставки генетического материала.
- Факторы ядерного стеминга играют важную роль в различных биологических процессах.
- Минимизация хирургических осложнений необходима для улучшения результатов экспериментов.
Цель исследования
- Сравнить эффективность внутриселезеночных инъекций и инъекций в воротную вену для нокдауна генов.
- Упростить процедуру при сохранении ее эффективности.
- Снизить количество периоперационных и послеоперационных осложнений.
Используемые методы
- Интраспленическая инъекция коротких шпилечных РНК, доставленных с помощью AAV8.
- Инъекция AAV8 в воротную вену в качестве сравнительного метода.
- Использование анестезированных мышей для проведения хирургических процедур.
- Статистический анализ для сравнения эффективности нокдауна генов.
Основные результаты
- Оба метода инъекции обеспечили статистически эквивалентную эффективность нокдауна генов.
- Интраспленическая инъекция сопровождалась меньшим количеством осложнений.
- Данная процедура оказалась проще по сравнению с инъекцией в воротную вену.
- Результаты подтверждают возможность использования интраспленической инъекции в качестве жизнеспособной альтернативы.
Выводы
- Интраспленическая инъекция AAV8 является эффективным методом нокдауна генов.
- Данный метод может способствовать развитию исследований в области генной терапии и регенеративной медицины.
- В последующих исследованиях могут быть изучены долгосрочные эффекты применения данной методики.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Эффективное и минимально инвазивное подавление экспрессии генов в печени имеет решающее значение для валидации мишеней и снижения рисков при изучении механизмов в исследованиях метаболизма, регенерации и онкологии. Протокол интраспленического введения AAV8-shRNA обеспечивает надежный сайленсинг генов при снижении процедурных рисков, что способствует получению достоверных данных функциональной геномики на моделях соответствующих заболеваний. Данный подход оптимизирует процессы раннего поиска и доклинические рабочие циклы за счет минимизации технических барьеров и периоперационных осложнений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить функциональный анализ генных мишеней в патофизиологии печени с использованием моделей in vivo.
- Способствует снижению механистических рисков за счет обеспечения надежного сайленсинга генов с минимальными побочными эффектами.
- Обеспечивает быструю проверку гипотез о функциях генов в метаболических и регенеративных путях.
Скрининг и разработка анализа
- Представляет собой валидированную систему для создания моделей с нокдауном генов, подходящих для последующего скрининга соединений.
- Обеспечивает воспроизводимое и количественное снижение экспрессии генов, что способствует стандартизации анализа.
- Снижает процедурную вариабельность, повышая масштабируемость и возможность повторного использования платформы для нескольких мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным заболеваниям системам in vivo для трансляционного поиска биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичного поиска до доклинической валидации за счет стабильной модуляции экспрессии генов.
- Способствует принятию взвешенных с учетом рисков решений о дальнейшем продвижении исследования путем минимизации технических и биологических искажающих факторов.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный протокол внутриселезеночного введения AAV8-shRNA интегрируется в процесс от этапа поиска мишени до доклинических исследований, обеспечивая эффективную валидацию мишеней и создание моделей для идентификации ведущих соединений и трансляционных исследований.
- Открывающая биология: ускоряет проверку гипотез и уточнение метаболических путей за счет обеспечения быстрого нокдауна генов in vivo.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимое сайленсинг генов, что способствует подготовке анализа и получению количественных данных.
- Аналитика: предоставляет статистически достоверные измерения снижения экспрессии генов для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: обеспечивают модуляцию генов, имеющих значение при данной патологии, в доклинических моделях, что способствует согласованию биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный, простой в исполнении протокол, который можно адаптировать для различных генных мишеней и моделей заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость, стандартизацию и процедурную безопасность в рабочих процессах нокдауна генов.
- Стратегическая ценность: Улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет снижения частоты технических сбоев.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию с учетом рисков и продвижение валидированных мишеней в доклинические разработки.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области хирургии мелких животных и работы с вирусными векторами.
- Необходим доступ к платформам для производства AAV8 и количественного анализа экспрессии генов.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами при выполнении протокола и интерпретации данных.
- Метод применим к различным генным мишеням, но может потребовать оптимизации для разных моделей заболеваний.
- Потенциальные ограничения включают иммуногенность вектора и процедурные ограничения, специфичные для конкретной модели.
