Платформа с многоэлектродной матрицей для моделирования эпилепсии с использованием ассамблоидов мозга человека, полученных из плюрипотентных стволовых клеток
27 сентября 2024 г.
Этот протокол направлен на стабильное латирование дорсально-вентральных сросшихся ассамблоидов на многоэлектродных решетках для моделирования эпилепсии in vitro.
За последние несколько десятилетий в результате бурного открытия генов были выявлены сотни генов, вызывающих эпилепсию или связанных с ней. Тем не менее, патогенные механизмы не так хорошо изучены. Наша лаборатория изучает, как генетические изменения влияют на раннее развитие мозга и приводят к порокам развития мозга и эпилепсии — изнурительному заболеванию, характеризующемуся хроническими судорогами.
Генетические эпилепсии обычно изучаются с использованием животных моделей, включая мышей, рыбок данио, дрозофил и кроликов. Стволовые клетки человека в последнее время используются для моделирования генетической эпилепсии, поскольку методы дифференцировки стволовых клеток в нейроткани продвинулись вперед. С появлением органоидов мозга вы можете повторить структурные аспекты развития мозга.
Измерение электрофизиологической активности и определение биомаркеров активности, связанной с эпилепсией, из органоидов и ассамблоидов мозга является сложной задачей. Отчасти этот метод ограничен тем, что органоиды мозга не могут испытывать припадков, как у неповрежденного животного. Тем не менее, обнаружение электрофизиологических различий в этой модели in vitro и ответах на медикаментозное лечение может помочь определить патологические механизмы и терапевтические реакции при генетической эпилепсии.
Электрофизиологическая активность может быть оценена с помощью традиционных записей патч-лазания, локальных полевых записей с электродами и оптических методов, таких как кальциевая и магнитная томография памяти. Преимущество использования записи с помощью многоэлектродной матрицы заключается в том, что она позволяет одновременно записывать две записи и записывать из нескольких мест сборки.
Обзор
В данном протоколе подробно описывается метод стабильного посева дорсо-вентральных слитых ассемблоидов на многоэлектродные матрицы (МЭМ) для моделирования эпилепсии in vitro. В работе рассматриваются сложности измерения электрофизиологической активности и изучения патологических механизмов генетических форм эпилепсии с использованием органоидов мозга, полученных из стволовых клеток человека.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследования эпилепсии
- Нейроразвитие
Теоретические сведения
- В результате генетических исследований было выявлено множество генов, связанных с эпилепсией.
- Патогенетические механизмы остаются недостаточно изученными, несмотря на успехи в моделировании.
- Стволовые клетки человека и органоиды мозга стали моделями для изучения генетических форм эпилепсии.
- Измерение нейронной активности в органоидах ограничено по сравнению с целыми моделями животных.
Цель исследования
- Разработать протокол стабильного посева ассемблоидов на мультиэлектродные матрицы (МЭМ).
- Исследовать электрофизиологические различия, наблюдаемые в моделях in vitro.
- Оценить ответы на лекарственную терапию при моделировании генетических форм эпилепсии.
Используемые методы
- Использование мультиэлектродных матриц (МЭМ) для электрофизиологической регистрации.
- Моделирование с использованием дорсо-вентральных слитых ассемблоидов, полученных из стволовых клеток человека.
- Критически важные этапы включают предварительную обработку поверхности МЭМ, подготовку лунок и размещение ассемблоидов.
- Наблюдение за созреванием нейронов с течением времени с оценкой сетевой активности.
Основные результаты
- По мере созревания нейронов наблюдалось увеличение продолжительности сетевых вспышек.
- Изменения клеточной и сетевой активности мониторились с течением времени и в конечном итоге затухали к 125-му дню.
- Оценка реакции на лекарственные препараты может помочь раскрыть патологические механизмы эпилепсии.
Выводы
- Данное исследование представляет надежный метод моделирования эпилепсии in vitro с использованием ассемблоидов на MEA.
- Полученные результаты позволяют детально изучить патологию и ответы на лечение при генетических формах эпилепсии.
- Полученные данные могут углубить понимание нейронных механизмов, связанных с эпилепсией.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Ассемблоиды мозга, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека и высеянные на мультиэлектродные матрицы (MEA), позволяют проводить лонгитюдное неразрушающее измерение активности нейронных сетей, имеющее значение для изучения эпилепсии. Данная платформа восполняет трансляционный разрыв между генетическими открытиями и механистическим пониманием процессов, предоставляя масштабируемую специфичную для человека систему для функционального анализа и профилирования лекарственного ответа. Этот подход повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней на ранних стадиях и служит основой для принятия решений по управлению портфелем разработок нейротерапевтических средств с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить функциональную оценку генетических вариантов, связанных с эпилепсией, с использованием нейронных цепей человеческого происхождения.
- Способствует механистическому снижению рисков путем выявления фенотипов на уровне сети и паттернов аберрантной активности.
- Облегчает проверку гипотез относительно интеграции возбуждающих и тормозных нейронов.
- Предоставляет платформу для оценки влияния потенциальных терапевтических воздействий на динамику сети, имеющую значение для заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает надежный лонгитюдный электрофизиологический анализ для количественной оценки сетевой активности в течение длительных периодов времени.
- Поддерживает воспроизводимое измерение полевых потенциалов, спайков и паттернов пачечной активности в нескольких ассемблоидах.
- Позволяет стандартизировать подготовку сложных 3D-нейронных систем для последующего скрининга соединений.
- Облегчает масштабируемый мультиплексный сбор данных для сравнительного анализа ответов на лекарственные препараты.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет фенотипы сетей in vitro с биомаркерами, имеющими значение для исследований эпилепсии.
- Обеспечивает преемственность от генетических открытий до доклинической валидации в контексте, специфичном для человека.
- Поддерживает продвижение кандидатов в нейротерапевтические препараты с поправкой на риск на основе функциональных показателей.
- Позволяет проводить механистическую оценку терапевтических вмешательств в контролируемой масштабируемой системе.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данная платформа ассемблоидов на основе MEA служит связующим звеном между этапом первичного поиска и доклиническими исследованиями, обеспечивая функциональную валидацию мишеней, разработку аналитических методов и согласование трансляционных биомаркеров при моделировании эпилепсии.
- Поисковая биология: обеспечивает проверку гипотез и снижение рисков при изучении механизмов путем количественной оценки сетевых эффектов генетических или фармакологических воздействий.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные электрофизиологические данные, подходящие для оценки соединений и стандартизации анализов.
- Аналитика: позволяет проводить лонгитюдные измерения сетевых вспышек, созревания и ответа на препараты для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: сопоставляет фенотипы in vitro с механизмами заболеваний, что способствует принятию доклинических решений на основе биомаркеров.
- Корпоративное использование: предлагает многократно используемую адаптируемую платформу для моделирования различных областей мозга и неврологических состояний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней и снижает механистическую неопределенность в исследованиях эпилепсии.
- Операционная ценность: стандартизирует сложные нейронные анализы для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости в различных группах НИОКР.
- Стратегическая ценность: оптимизирует процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет получения функциональных данных на человеческом материале на ранних этапах разработки.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию и продвижение нейротерапевтических активов с учетом рисков на основе надежных функциональных доказательств.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области дифференцировки стволовых клеток, культивирования органоидов и настройки электрофизиологического анализа.
- Необходим доступ к оборудованию для мультиэлектродных матриц и аналитической инфраструктуре для получения высококонтентных данных.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов посева, поддержания культур и анализа данных.
- Метод применим к различным органоидам специфических областей мозга, но может потребовать оптимизации для разных типов тканей.
- Стабильность длительного культивирования и записи данных имеет решающее значение для достоверности лонгитюдных исследований.
