Гликопротеомика под контролем гликомики способствует комплексному профилированию гликопротеома в сложных опухолевых микроокружениях

Поэтому мы изучаем сложные углеводы, или гликаны, во врожденной иммунной системе и иммунных расстройствах, уделяя особое внимание сепсису и раку. Наша работа включает в себя аналитические методы и системную гликобиологию, включая методы гликомики и гликопротеомики, для детальной характеристики гликопротеина человека. За последние десятилетия гликопротеомика претерпела огромные успехи, и прогресс больше не ограничивается нехваткой высококачественных данных масс-спектрометрии.

Скорее, задача состоит в том, чтобы интерпретировать и генерировать биологические знания на основе спектральных данных. Метод гликопротеомики под руководством гликотехники позволяет ученым, изучающим глико, получить глубокое и точное представление о гликопротеоме и жестких барьерах с индексами здоровья человека. Но показатели гликопептидов остаются высокими.

Чтобы решить эти проблемы воспроизводимости, наш метод гликопротеомики обеспечивает прецизионное профилирование гликопротеомии путем определения ограничений в пространстве поиска гликана с помощью гликомического исследования одного и того же образца. В конечном счете, это позволяет быстрее и точнее искать гликопептиды. Наш метод гликопротеомики под контролем гликомики позволяет всесторонне отображать гетерогенность и динамику индексов гликопротеомии из множества различных образцов человека.

Таким образом, этот метод может помочь нам лучше понять прогрессирование заболевания, а также помочь нам найти новые диагностические биомаркеры для терапевтических мишеней против широкого спектра заболеваний человека. Метод гликопротеомики под руководством гликомики позволяет нам расшифровать сложность гликопротеома человека, что, в свою очередь, открывает новые биологические вопросы, такие как влияние гликановых структур на функцию белка, клеточную коммуникацию или иммунные реакции. Это также поднимает вопросы о том, как и почему характер гликозилирования изменился при определенных заболеваниях.

И эти знания могут привести к открытиям и новым диагностическим маркерам и персонализированным методам лечения сложных заболеваний. Чтобы иммобилизовать интересующий белок на мембране из ПВДФ, используя прокол с одним отверстием, разрежьте мембрану в зависимости от количества образцов, которые должны быть обнаружены. Смочите иссеченные мембраны метанолом, затем переложите их на 96-луночный планшет с плоским дном.

Как только мембраны почти высохнут, нанесите 2,5 микролитра образцов белка на каждое пятно. Высушите мембраны на воздухе при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия в течение не менее трех часов, а лучше в течение ночи, стараясь избежать загрязнения. Добавьте 100 микролитров 1%PDP-40 в метаноле в каждую лунку, содержащую пятнистые мембраны.

Встряхните пластину в растворе PDP-40 при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. Через пять минут выбросьте раствор PDP-40. Далее промойте каждую лунку, содержащую заблокированные белковые пятна, 100 микролитрами сверхчистой воды и встряхивайте тарелку в течение пяти минут.

Добавьте по 15 микролитров раствора PNGase F в каждую лунку. Чтобы предотвратить обезвоживание, добавляйте воду в окружающие пустые колодцы. Аккуратно запечатайте пластину прозрачной пленкой и выдерживайте не менее восьми часов при температуре 37 градусов Цельсия.

После инкубации обработайте пластину ультразвуком в течение пяти минут, чтобы любые испарившиеся капли по бокам лунок собрались на дне. Перенесите высвободившиеся образцы N-гликана в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Дважды хорошо промойте каждый образец 20 микролитрами сверхчистой воды, отсасывая и объединив все оставшиеся образцы в новые пробирки.

Затем добавьте 10 микролитров 100-миллимолярного ацетата аммония pH 5 и инкубируйте образцы в течение одного часа при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. Высушите образцы N-гликана в вакуумной концентраторе. Чтобы приготовить самодельный пористый графитовый углерод, или твердофазную экстракцию PGC-C18, или микроколонки SPE, используйте шприц для закупорки и переноса дисков C18 в наконечники для пипеток объемом 10 микролитров.

Пипетируйте 10 микролитров суспензии из смолы PGC, взвешенной в 50% метаноле, в микроколонки C18 SPE. Поместите микроколонки в 2-миллилитровые пробирки с адаптерами для микроцентрифуг. Вращайте трубки, чтобы создать микроколонны PGC-C18 SPE с приблизительной высотой колонны 0,5 сантиметра.

Затем добавьте 50 микролитров 0,1% трифторуксусной кислоты, или ТФК, в ацетонитриле в микроколонки и центрифугируйте при 2000 G в течение 60 секунд, чтобы облегчить прохождение подвижных фаз через микроколонки. Аналогичным образом вымойте и кондиционируйте микроколонки три раза, используя 0,1% водный раствор TFA. Нанесите образцы N-гликана на каждую микроколонку в объеме загрузки до 40 микролитров.

Вращайте микроколонку после каждого выпуска, повторяя до тех пор, пока не будет загружен весь образец. Промойте каждый микростолбик 20 микролитрами сверхчистой воды. Перенесите микроколонки в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.

Чтобы разбавить N-гликаны, добавьте 40 микролитров 0,1% TFA в 50% ацетонитриле в каждую микроколонку. Вращайте трубки и комбинируйте элюат от каждого спина. Высушите обессоленные N-гликаны в системе вакуумных концентраторов.

Просмотрите сгенерированные необработанные данные LC-MS/MS с помощью соответствующего программного обеспечения. Подтвердите высокое качество данных путем оценки узкой ширины пика LC, эффективного разделения изомеров N-гликанов, высокой точности МС, разрешения и соотношения сигнал/шум, а также высокой эффективности фрагментации МС/МС CID. Вручную определите N-гликаны в образце на основе массы моноизотопного предшественника, характера фрагментации CID MS/MS, а также относительного и абсолютного времени удержания PGC-LC.

Для количественного определения относительного N-гликана сгенерируйте список переходов, содержащий отношение массы моноизотопного предшественника к заряду для всех идентифицированных изомеров N-гликанов. Определите площадь под кривой значений по выделенным ионным хроматограммам всех ионов-предшественников N-гликанов. Чтобы приготовить микроколонки ZIC-HILIC-C8-SPE, с помощью шприца закупорьте и перенесите диски C8 в наконечники для пипеток объемом 10 микролитров.

Нанесите суспензию смолы ZIC-HILIC, взвешенной в метаноле, в микроколонны C8-SPE. Поместите микроколонны в 2-миллилитровые пробирки с адаптерами для микроцентрифуг, убедившись, что колонны подвешены в центре. Spin для создания микроколонн C8-SPE HPLC с приблизительной высотой одного сантиметра.

Добавьте 50 микролитров метанола в микроколонки и центрифугируйте при 2000 G в течение 60 секунд, позволяя подвижным фазам проходить через колонну. Аналогичным образом промойте микроколонки три раза, каждый из которых содержит 50 микролитров сверхчистой воды, а затем 50 микролитров 1% TFA в 80% ацетонитриле. Суспендировать высушенные пептидные смеси, предназначенные для обогащения N-гликопептидами, в 50 мкл 1%TFA в 80%ацетонитриле и тщательно перемешать.

Поместите микроколонки ZIC-HILIC-C8-SPE в новые 1,5-миллилитровые пробирки с адаптерами для микроцентрифуг. Нанесите ресуспендированные пептидные смеси на каждый микростолбик и вращайте при 2000 G в течение 60 секунд. Соберите проточные фракции и повторно нанесите каждую фракцию на ту же микроколонку ZIC-HILIC-C8-SPE.

Затем элюируют N-гликопептид с последовательным добавлением 50 микролитров 25-миллимолярного бикарбоната аммония и 50 микролитров 50%-ного ацетонитрила. Перенесите микроколонки в новые 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки с низкой связываемостью. Чтобы последовательно элюировать оставшийся N-гликопептид, добавьте 50 микролитров 0,1%-ной водной ТЖК в микроколонки и центрифугируйте при 2000 G в течение 60 секунд.

Затем элюируют N-гликопептид с последовательным добавлением 50 микролитров 0,1% водной ТФК, а затем 50 микролитров 25-миллимолярного бикарбоната аммония и 50 микролитров 50% ацетонитрила. Соберите, объедините и высушите обогащенные N-гликопептиды и немодифицированный пептид через фракции в системе вакуумного концентратора. Анализ данных N-гликомики идентифицировал 76 изомеров N-гликанов в тканях колоректального рака, содержащих 70% сложных/гибридных гликанов, 20% олигоманнозу и 10% пауциманнозу.

Все структуры N-гликанов были подтверждены спектральными данными, количественно оцененными с использованием площадей под значениями кривой из экстрагированных ионных хроматограмм.