Визуализация кальция в отдельных клетках для изучения активации ионных каналов кальция
13 декабря 2024 г.
В данной статье представлен метод количественного мониторинга концентраций ионов кальция (Ca2+) в клетках в режиме реального времени с помощью визуализации Ca2+ в одиночных клетках с помощью красителя Fura-2/AM. Этот метод обеспечивает эффективную загрузку красителя и точный расчет уровнейCa2+ с помощью соотношений интенсивности флуоресценции, что делает его простым и быстрым подходом для исследовательских применений.
Мы изучили наши каналы, связанные с ощущением температуры, ощущением возраста и ощущением боли. Мы заинтересованы в экранировании низкомолекулярной активности в наших каналах и изучении механизмов их проведения. Мы провели скрининг двух активирующих TRPV1 агонистов и провели детальное исследование механизмов их действия.
Эта технология позволяет проводить количественный и одновременный мониторинг изменений кальция в нескольких клетках в режиме реального времени, что делает ее простым и быстрым подходом к исследовательским приложениям. Мы стремимся изучить механизм лечения различных заболеваний традиционной китайской медициной путем модернизации ионных каналов, связанных с кальцием. Для начала подготовьте стерильные стеклянные стекла диаметром восемь миллиметров и поместите их в 24-луночную пластину.
Добавьте в каждую лунку по 500 микролитров буфера Poly-D-lycine. Инкубируйте предметные стекла при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы обеспечить покрытие. Затем с помощью пипетки сбросить раствор покрытия из каждой лунки.
Вымойте слайды один раз с помощью PBS от Dulbecco и отложите вымытые слайды для последующего использования. Высейте клетки на подготовленную 24 луночную пластину с плотностью примерно 1,5 х 10 в степени 5 клеток на лунку, и поместите пластину в инкубатор до тех пор, пока клетки не прилипнут. Далее смешайте стоковый раствор Фура-2/АМ и Плурон Ф-127 с буфером Хэнка, содержащим 1,3 миллимолярных ионов кальция.
С помощью алюминиевой фольги накройте рабочий раствор Фура-2/АМ для защиты от света. Для предварительной обработки клеток перенесите предметные стекла с ячейками на новую 24-луночную пластину, содержащую буфер Хэнка. С помощью пипетки выбросьте буфер из каждой лунки и добавьте в каждую лунку по 500 микролитров рабочего буфера Фура-2/АМ.
Инкубируйте планшет при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут, чтобы обеспечить загрузку зонда. Затем извлеките рабочий буфер Фура-2/АМ из каждой лунки и трижды промойте ячейки буфером Хэнка, чтобы удалить излишки Фура-2/АМ. Для начала получите предварительно обработанные клетки для визуализации одиночных клеток кальция и запустите все компоненты флуоресцентного микроскопа.
Откройте программное обеспечение для флуоресцентной визуализации из доступных вариантов. Выберите нужный протокол и нажмите «ОК». Затем выберите «Новый эксперимент» в главном меню, чтобы начать новую экспериментальную настройку.
Теперь установите перфузионную камеру на предметный столик микроскопа и осторожно поместите обработанные Fura-2/AM предметные стекла в камеру, содержащую буферный раствор Хэнка. Отрегулируйте фокусировку под белым светом для оптимального просмотра. Выберите Фокус на панели управления экспериментом.
Выберите желаемую длину волны для фокусировки, например 380 нанометров, и нажмите «Начать фокусировку», чтобы начать настройку фокуса. Отрегулируйте фокус на ячейках с помощью функции «Грубый фокус», чтобы приблизить объектив, а затем нажмите «Найти фокус» для точной настройки. Наблюдайте за экспрессией целевого белка по длинам волн FITC или TRITC.
Затем нажмите «Остановить фокусировку» и закройте панель фокусировки. Нажмите «Настроить эксперимент» на панели задач и выберите нужные этажи для визуализации в настройках конфигурации. Теперь нажмите кнопку «Область» в строке меню, чтобы определить области для визуализации, и выберите тип «Желаемое освещение» для визуализации.
Нажмите «Получить изображения», затем нажмите «ОК», чтобы захватить изображения. Определите нужные клетки, экспрессирующие целевой белок под действием флуоресценции, учитывая пустое считывание с контролем менее 380 нм. Чтобы отменить выбранную область, щелкните правой кнопкой мыши по кругу и выберите «Удалить область».
Откройте меню «Ссылки», установите флажок «Вычесть ссылки» и нажмите «ОК», чтобы применить фоновое вычитание. На панели управления экспериментом нажмите кнопку Данные журнала, чтобы записать данные эксперимента. В разделе «Таймлапс» панели управления установите интервал сбора данных на одну секунду.
Затем нажмите Zero Clock и Acquisition на панели управления экспериментом, чтобы начать сбор данных. Теперь примените обработку клеток в соответствии с требованиями. После завершения сбора данных нажмите «Пауза», чтобы остановить процесс.
Сохраните полученные данные и приступайте к анализу. Чтобы завершить эксперимент, нажмите «Файл» и выберите «Закрыть эксперимент». Наконец, закройте программное обеспечение и перенесите все сохраненные данные с компьютера.
Первичные кератиноциты, загруженные зондом Fura-2, отображали видимую морфологию клеток на длине волны 380 нанометров. Тепловой отклик кератиноцитов показал увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция при нагревании, аналогичная реакция наблюдалась при охлаждении. Тепловой ответ был отменен в кератиноцитах, в которых отсутствовал ген STIM1, что указывает на роль гена в термической передаче кальциевой сигнализации.
HEK293T клетки с избыточной экспрессией STIM1/Orai1 показали заметную тепловую реакцию при охлаждении, подтвердив успешную экспрессию генов, о чем свидетельствуют зеленые и красные флуоресцентные маркеры. Реакция на вход кальция в клетках на экспрессию STIM1-Orai1 была эффективно индуцирована последовательными изменениями внеклеточной концентрации кальция и издания циклопиазоновой кислоты через обильность. Прямое пипетирование капсаицина, агониста TRPV1, вызывало внеклеточный приток кальция в клетки, экспрессирующие плазмиду TRPV1.
Обзор
В данной статье представлен метод количественного мониторинга концентрации ионов кальция (Ca2+) в клетках в режиме реального времени с использованием метода визуализации Ca2+ в отдельных клетках с помощью красителя Fura-2/AM. Этот метод эффективен для исследования каналов температурной и болевой чувствительности, обеспечивая эффективное насыщение клеток красителем и точный расчет уровней Ca2+ на основе соотношения интенсивностей флуоресценции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Кальциевая сигнализация
Теоретические основы
- Исследованы каналы, связанные с температурной чувствительностью и болевым ощущением.
- Проведен скрининг малых молекул, влияющих на каналы TRPV1.
- Мониторинг в режиме реального времени позволяет одновременно наблюдать за несколькими клетками.
- Изменения концентрации ионов кальция имеют ключевое значение для понимания сенсорных механизмов.
Цель исследования
- Изучение механизмов действия активирующих агонистов TRPV1.
- Исследование механизмов терапевтического действия препаратов традиционной китайской медицины через кальций-зависимые ионные каналы.
- Разработка экспресс-метода для исследовательских приложений по изучению клеточных ответов.
Используемые методы
- Метод визуализации отдельных клеток с использованием красителя Fura-2/AM.
- Культуры кератиноцитов и клеток HEK293T с гиперэкспрессией белков, связанных с кальциевым сигналингом.
- Протоколы инкубации и обработки для загрузки красителя и сбора данных.
- Для мониторинга клеточных ответов применялась флуоресцентная микроскопия.
Основные результаты
- В кератиноцитах наблюдалось повышение внутриклеточной концентрации кальция при нагревании и охлаждении.
- Данные реакции были связаны с наличием гена STIM1, что подчеркивает его роль в термическом кальциевом сигналинге.
- Агонисты TRPV1 вызывали значительный приток кальция в модифицированных клеточных линиях.
- Были продемонстрированы эффективные пути передачи кальциевых сигналов для дальнейшего терапевтического изучения.
Выводы
- В исследовании продемонстрирован надежный метод мониторинга динамики ионов кальция в живых клетках.
- Работа расширяет понимание функций сенсорных каналов в регуляции боли и температуры, что имеет решающее значение для разработки новых методов лечения.
- Общие выводы включают более глубокое понимание нейронных механизмов и потенциальные возможности применения в моделях заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Одноклеточный кальциевый имиджинг с использованием Fura-2/AM позволяет проводить количественную оценку активации кальциевых ионных каналов в режиме реального времени в ответ на различные стимулы, что способствует снижению механистических рисков на ранних этапах поиска лекарств. Данный подход обеспечивает получение высококонтентных мультиплексных данных, критически важных для валидации мишеней и функциональной характеристики ионных каналов, участвующих в сенсорных путях. Этот метод повышает точность прогнозирования в ключевых точках принятия решений в портфелях разработки препаратов, воздействующих на ионные каналы.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает возможность прямого изучения механизмов активации кальциевых каналов при контролируемой стимуляции.
- Поддерживает функциональную валидацию эндогенных и сверхэкспрессированных ионных каналов-мишеней.
- Способствует снижению механистических рисков путем установления связи между генетическими или фармакологическими воздействиями и количественными клеточными ответами.
- Предоставляет мультиплексные данные с разрешением до одной клетки для обеспечения высокой достоверности выбора мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированные количественные показатели для разработки и оптимизации анализа.
- Позволяет воспроизводимо измерять поток ионов кальция в ответ на действие низкомолекулярных агонистов или антагонистов.
- Обеспечивает готовность к скринингу за счет возможности одновременного мониторинга нескольких клеток и условий.
- Формирует данные в формате .XLSX для упрощенного последующего анализа и интеграции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Связывает функциональные показатели с патологически значимыми путями, такими как болевая и температурная чувствительность.
- Обеспечивает преемственность от клеточных моделей до доклинической валидации модуляторов ионных каналов.
- Поддерживает разработку трансляционных биомаркеров путем количественной оценки клеточного ответа на исследуемые терапевтические средства.
- Предоставляет данные о механизмах действия для принятия обоснованных решений по продвижению препарата с учетом рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс визуализации кальция в отдельных клетках связывает этапы первичного поиска, разработки анализа и трансляционных исследований мишеней ионных каналов.
- Фундаментальная биология: Количественная визуализация кальция способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов для сенсорных ионных каналов.
- Скрининг: Стандартизированные измерения соотношения флуоресценции обеспечивают воспроизводимую оценку соединений и масштабируемость анализа.
- Аналитика: Количественные данные в режиме реального времени упрощают статистическое сравнение экспериментальных условий и механистическую интерпретацию.
- Трансляционные исследования: Функциональные данные об активации каналов помогают в выборе доклинических моделей и согласовании биомаркеров.
- Применение в организации: Платформа визуализации и конвейер анализа адаптируемы для различных мишеней-ионных каналов и клеточных систем.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней ионных каналов.
- Операционная ценность: оптимизирует сбор, стандартизацию и воспроизводимость данных в различных экспериментах.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет получения надежных функциональных данных на ранних этапах разработки.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию и продвижение модуляторов ионных каналов с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с флуоресцентной микроскопией и количественным анализом изображений.
- Необходим доступ к калиброванному оборудованию для визуализации и совместимому программному обеспечению для анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация процедур введения зондов, протоколов стимуляции и обработки данных.
- Метод применим к различным типам клеток, экспрессирующих эндогенные или рекомбинантные ионные каналы.
- Потенциальные ограничения включают фотовыгорание и необходимость тщательного контроля эффективности введения зонда.
