Регистрация внутренних выпрямляющих токов K⁺ в свежевыделенных гладкомышечных клетках базилярной артерии методом Patch Clamp

Мои исследования в основном сосредоточены на кардио-цереброваскулярной электрофизиологии. В этом исследовании описывается метод выделения первичных сосудистых мышечных клеток и использования технологии зажима для целых клеток для улучшения их электрофизиологических свойств. Выделение свежих клеток имеет ограничения, такие как влияние температуры на разделение ферментов, различное время переваривания для различных кровеносных сосудов и мгновенная способность в нативной среде клеток.

Кроме того, технология зажимного зажима создает проблемы при разрыве потолка и мембраны, что требует квалифицированной эксплуатации. Этот протокол исследования заключается в легком получении активных первичных клеток из мануальных артерий и быстром применении техники зажима. Для начала наполните чашку Петри холодным физиологическим раствором, насыщенным на 95% кислородом и 5% углекислым газом.

Поместите изолированный мозг крысы в чашку Петри. Расположите мозг вентрально вверх в чашке Петри и закрепите ее иглами. Под световым микроскопом найдите базилярную артерию.

С помощью автоклава, пинцета и ножниц аккуратно удалите окружающие ткани. Далее в изолированную базилярную артерию вводят проволоку длиной два сантиметра диаметром 25 микрометров. Аккуратно потрите внутреннюю стенку артерии проволокой, чтобы эффективно удалить эндотелий сосудов.

Чтобы выделить гладкомышечные клетки, сначала разогрейте растворы в пробирках от одного до трех. Перенесите изолированную базилярную артерию во вторую пробирку. Инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, непрерывно вводя в пробирку смесь 95% кислорода и 5% углекислого газа.

Далее перенесите базилярную артерию из пробирки два в пробирку три и инкубируйте. Перелейте один миллилитр предварительно нагретого раствора для разделения клеток из пробирки номер один в пробирку номер три. Продолжайте вводить 95% кислорода и 5% углекислого газа, сохраняя ферментативную обработку в течение трех минут.

Растирать препарат базилярной артерии для высвобождения клеток. Далее пипеткой четыре миллилитра раствора холодной сепарации в пробирку три, чтобы завершить ферментативный процесс. Центрифугируйте смесь при 59 г в течение шести минут.

С помощью пипетки выбросьте надосадочную жидкость. Затем снова добавьте раствор для холодной сепарации. После последнего мытья удалите надосадочную жидкость.

Оставьте один миллилитр клеточной суспензии. Храните клеточную суспензию при температуре четыре градуса Цельсия в течение шести-восьми часов. Перенесите 100 микролитров клеточной суспензии в ванну.

Добавьте в ванну один миллилитр внеклеточной жидкости и дайте ей отдохнуть. Для начала включите полярик с микропипеткой. Поместите стеклянную трубку в поляр.

На панели управления выберите одну программу. Нажмите Enter и получите доступ к первой программе. Теперь проведите испытание на рампу, нажав кнопку «Рампа» на панели управления, чтобы измерить теплоту стеклянной трубки.

Вставьте новую стеклянную трубку. Затем выберите первую программу и нажмите клавишу Enter, чтобы изготовить микропипетку. Чтобы записать текущий ток ухода, сначала запустите программное обеспечение для сбора данных.

Выберите файл, затем нажмите на «Задать имена файлов данных», чтобы установить путь к хранению данных. Включите функцию проверки мембраны в меню инструментов. Поместите образец изолированных гладкомышечных клеток из базилярной артерии крысы в центр обзора камеры микроскопа.

Погрузите наконечник контрольного провода в раствор для ванны. Затем заполните 20% изготовленной микропипетки внутриклеточным раствором. Закрепите заряженную микропипетку на держателе записывающего электрода.

Теперь с помощью шприца приложите положительное давление. Переместите наконечник пипетки в раствор для ванны и отрегулируйте смещение пипетки в программном обеспечении усилителя сигнала, чтобы установить текущий базовый уровень равным нулю пикоампер. Аккуратно прижмите пипетку к клеточной мембране.

Наблюдайте повышение устойчивости к уплотнениям хотя бы до одного магоме. Снимите положительное давление и приложите отрицательное давление. Чтобы установить высокое сопротивление, при сопротивлении уплотнения не менее одного гиггома, установите удерживающее напряжение на минус 60 милливольт и компенсируйте емкость электродов с помощью CP FAST и CP slow.

Приложите кратковременное отрицательное давление, чтобы разорвать клеточную мембрану, образуя целую клеточную конфигурацию. Выберите целую ячейку в программном обеспечении усилителя сигнала. Затем нажмите «Авто» для компенсации емкости мембраны.

Загрузите протокол kir и начните запись данных. Были выделены свежевыделенные гладкомышечные клетки с веретенообразной морфологией. Клетки были здоровыми и пригодными для экспериментов с патч-клэмпингом.

Типичный ток отверждения проявлял внутреннее выпрямление при отрицательных напряжениях с минимальным или отсутствующим током ионов калия при положительных напряжениях. Хлорид бария в концентрациях от 100 до 300 мкм на литр эффективно ингибировал активность кир-каналов, подтверждая ток как кир. Нитропруссид натрия увеличивал ток кира, что указывает на роль кир-каналов в индуцированной SNP вазодилатации.

Сравнение соотношений напряжения тока показало снижение плотности тока в присутствии хлорида бария и увеличение при использовании SNP.