Масс-цитометрический анализ системных и местных иммунных реакций при гепатоцеллюлярной карциноме

Масс-цитометрия позволяет анализировать как систематические, так и местные иммунные реакции при гепатоцеллюлярной карциноме. Профилируя иммунные клетки на уровне отдельных клеток, мы выявляем уникальные подмножества и функциональные состояния, связанные с прогрессированием опухоли, что дает представление о механизмах уклонения от иммунитета и потенциальных терапевтических мишенях для персонализированного лечения. Наш протокол использует массовую цитометрию для одновременного анализа более 14 маркеров на уровне отдельных клеток, избегая спектрального перекрытия, наблюдаемого при традиционной проточной цитометрии. Это включает в себя точную идентификацию реальных клеточных популяций и предоставляет многомерные данные для детального иммунного профилирования и открытия биомаркеров.

[Рассказчик] Для начала разморозьте замороженные мононуклеарные клетки периферической крови и суспензии клеток гепатокарциномы. После восстановления клеток ресуспендируйте клетки в одном миллилитре PBS без кальция и магния. Добавьте цисплатин до конечной концентрации 0,5 микромоля, хорошо перемешайте и выдерживайте при комнатной температуре в течение двух минут. Чтобы остановить реакцию, центрифугируйте пробирки при 500 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, затем добавьте по одному миллилитру буфера для окрашивания клеток в каждую пробирку. После повторного центрифугирования аккуратно выбросьте надосадочную жидкость. Чтобы выполнить блокирование рецепторов ФК, сначала приготовьте смесь блоков объемом 50 микролитров для каждого образца, соедините 48 микролитров буфера для окрашивания клеток с двумя микролитрами раствора для блокирования ФК. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в блочной смеси и инкубируйте. Затем добавьте по 1,1 микролитра каждого антитела на образец в меченую пробирку, чтобы приготовить смесь антител мембранного белка. Восполните объем до 55 микролитров с помощью буфера для окрашивания клеток. В каждую пробирку с образцом переложите по 50 микролитров приготовленной смеси антител, доведя общий объем до 100 микролитров. Затем аккуратно взболтайте образцы и перемешайте перед инкубацией при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте один миллилитр буфера для окрашивания клеток в каждую пробирку с образцом. Центрифугируйте при 500 G в течение пяти минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. После окончательной промывки кратковременно перебейте оставшуюся жидкость с клеточной гранулой, чтобы полностью ресуспендировать клетки. Для окрашивания белков ядра добавьте 500 микролитров раствора смешанной фиксации в ресуспензионные клетки. Аккуратно перемешайте образцы перед инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации центрифугируйте при 500 G в течение пяти минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Далее пипеткой подайте 1000 микролитров пермеабилизационного буфера в каждую пробирку для промывания клеток. Затем центрифугируйте пробирки при 1000 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Добавьте по 50 микролитров смеси антител в каждую пробирку после удаления надосадочной жидкости. Аккуратно пипеткой тщательно перемешайте клетки перед инкубацией. Далее пипеткой нанесите 1000 микролитров буфера для пермеабилизации в каждую пробирку, снова центрифугируете, затем выбросьте надосадочную жидкость. Чтобы закрепить клетки, добавьте в каждую пробирку с образцом по одному миллилитру 1,6% формальдегида, приготовленного в PBS, и вортекс тщательно перемешайте содержимое. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут образцы центрифугируют и выбросили надосадочную жидкость. Для окрашивания ядерной интеркаляцией сначала разбавляют Cell-ID Intercalator Iridium с фиксацией и буфером для пермеабилизации. Внесите пипеткой один миллилитр раствора для интеркаляции в каждый образец. Аккуратно перемешайте и заворох. Поместите образцы при температуре четыре градуса Цельсия на ночь, затем центрифугируйте, как и раньше. Когда инкубация будет завершена, введите пипеткой 1000 микролитров буфера для окрашивания клеток в пробирку. Центрифугируйте пробирки при 800 G в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Наконец, ресуспендируйте клетки в 450-900 микролитрах деионизированной воды. Покрасьте клетки трипановым синим для подсчета клеток перед дальнейшим анализом. Для начала включите масс-цитометр и запустите программу. Проанализируйте образцы в системе CyTOF и получите массовые цитометрические данные мононуклеарных клеток периферической крови и образцов клеток гепатокарциномы. Запустите программное обеспечение для обработки данных на приборе и выполните предварительную обработку популяции клеток CD45+ в файле FCS. Затем удалите мертвые клетки с помощью окрашивания на жизнеспособность, такого как исключение цисплатина. Гейт-популяция CD45+, чтобы сосредоточиться на иммунных клетках, и экспортировать гейтированную популяцию для дальнейшего анализа. Преобразуйте данные с коэффициентом пять. Далее запустите программу кластеризации и определите основные кластеры на основе алгоритма SPADE, сгруппировав ячейки с похожими профилями экспрессии маркеров в кластеры. Применяйте иерархическое стохастическое встраивание соседей (HSNE) для уменьшения размерности и идентификации отдельных кластеров. Затем используйте пакет CyTOF в нашем программном обеспечении для выполнения повторной кластеризации основных кластеров. Используйте программу PhenoGraph для определения подкластеров с параметрами по умолчанию. В общей сложности 14 различных типов клеток были идентифицированы в образцах мононуклеарных клеток периферической крови. Паттерны экспрессии маркеров для каждого из 14 типов клеток были подробно описаны на тепловой карте, показывающей уникальные профили экспрессии для различных популяций клеток. Распределение этих типов клеток варьировало в разных образцах: образец D имел более высокую долю CD4 Т-клеток, образцы A и B демонстрировали значительное обогащение B-клеток, а CD141+ — обычные дендритные клетки, преимущественно присутствующие в образце C. В образцах тканей было идентифицировано восемь типов клеток, включая моноциты, Т-клетки, нейтрофилы, естественные киллеры. В-клетки, плазмоцитоидные дендритные клетки, эозинофилы и миелоидные дендритные клетки. Профили экспрессии маркеров для типов клеток тканей указывают на различные паттерны для каждой популяции клеток. Образцы тканей показали постоянную пропорцию типов клеток у всех пациентов, отражающую общие иммунологические характеристики с гепатоцеллюлярной карциномой.