3D-визуализация сосудистых перицитов сетчатки у мышей методом иммуноокрашивания

Целью данного исследования является изучение морфологии и пространственного распределения паразитов в сосудистой сети сетчатки с использованием передовых методов визуализации. Для того, чтобы получить подробное представление о морфологических характеристиках паразитов, в исследовании был описан новый подход, сочетающий ретроорбитальную инъекцию флуоресцентного агента, иммунофлуоресцентное окрашивание и очищение тканей для продвижения исследований в нашей области.

По сравнению с предварительным очищением ткани сетчатки мыши, фоновые сигналы кровеносных сосудов и паразитов, меченных флуоресцентным томатным лактином и PDGFR-бета, значительно снижаются после очищения тканей, что способствует более точному наблюдению за их пространственным соотношением.

Наши результаты показывают, что эти методы хорошо совместимы для демонстрации паразитов в сосудистой сети сетчатки во всей сетчатке. Комбинация этих гистологических методов является эффективным подходом к детальной визуализации морфологических характеристик паразитов в трехмерном виде.

[Инструктор] Для начала поместите мышь под наркозом в правую боковую лежачую кровать головой влево. Аккуратно надавите двумя пальцами на периорбитальную область, чтобы обнажить левый глаз мыши. С помощью одномиллилитрового шприца, оснащенного иглой 27-го калибра, аккуратно проколите около двух-трех миллиметров в орбитальный венозный синус, следя за тем, чтобы скос иглы был направлен вперед под углом 45 градусов. Введите 0,1 миллилитра флуоресцентного лактина томата в орбитальный венозный синус. После пяти минут ретроорбитальной инъекции усыпите мышь и с помощью хирургических ножниц откройте грудную полость. Введите иглу 24-го калибра на два миллиметра в левый сердечный желудочек через верхушку левого желудочка. Выполняйте перфузию со скоростью три миллилитра в минуту 20 миллилитров 0,9% физиологического раствора, а затем 20 миллилитров 4% физиологического раствора. Введите 0,1 миллилитра 0,9% формальдегида в 0,1 молярного фосфатного буфера. Далее положите принесенную в жертву мышь на бок и снимите ножницами кожу, закрывающую глаза. Энуклеируйте глаза с помощью ножниц и щипцов. Разрежьте зрительный нерв и окружающие ткани и поднимите глаз. Перенесите глаз на 12-луночный планшет для фиксации в 4% формальдегиде в 0,1 молярного фосфатного буфера на два часа. После фиксации криопротектор глаза в 25% сахарозе в 0,1 молярном фосфатном буфере при четырех градусах Цельсия до тех пор, пока он не опустится на дно раствора. С помощью пластиковой пипетки перенесите глаз в чашку Петри, содержащую 0,1 молярного фосфатного буфера. Проткните край роговицы острыми ножницами, разрежьте вокруг роговицы и радужной оболочки и выбросьте их. С помощью щипцов снимите хрусталик и стекловидное тело. Затем с помощью тонких щипцов оттяните чашеобразную сетчатку от центра глаза. Промойте сетчатку 0,1 молярфосфатным буфером в чистой чашке Петри. После выделения чашеобразной сетчатки мыши инкубируйте ее в 20-часовом инкубаторе с 2% раствором Triton X-100 в 0,1 молярном фосфатном буфере в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день перенесите сетчатку в блокирующий раствор и вращайте со скоростью 72 оборота в минуту на шейкере в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Затем поместите сетчатку в микроцентрифужную пробирку, содержащую первичные антитела козьего анти-PDGFR бета в буфере для разведения. Вращайте трубку на шейкере в течение двух дней при температуре четыре градуса Цельсия. Через двое суток дважды промойте сетчатку промывочным буфером комнатной температуры. Поместите сетчатку в буфер для стирки и перенесите ее в шейкер на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день перенесите сетчатку в микроцентрифужную пробирку, содержащую раствор одного миллиграмма на миллилитр вторичного антитела осла антикозы 488 и 0,2 нанограмма на миллилитр флуоресцентного ядерного красителя DAPI. Вращайте трубку на шейкере со скоростью 72 об/мин в течение пяти часов при температуре четыре градуса Цельсия. Промойте сетчатку в шестилуночной пластине с промывочным буфером в течение одного часа дважды при комнатной температуре. Инкубируйте сетчатку в промывном буфере на шейкере на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день перенесите сетчатку в реагент для очищения тканей и аккуратно вращайте ее на шейкере со скоростью 60 об/мин в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. После очищения тканей промойте сетчатку 0,1 молярфосфатным буфером в чистой чашке Петри. С помощью пружинных ножниц сделайте четыре радиальных разреза, достигающих примерно 2/3 радиуса сетчатки, чтобы создать форму лепестка. Расплющите сетчатку и закрепите ее на предметном стекле микроскопа внутренней стороной сетчатки вверх. Используйте небольшой лист абсорбирующей бумаги, чтобы удалить избыток фосфатного буфера. Обведите установленную сетчатку с помощью спейсера. Заполните промежуток свежим реагентом для очистки тканей и положите сверху защитный листок. Сканируйте монтажные изображения помеченной сетчатки с помощью панорамного сканера срезов тканей. Делайте снимки с большим увеличением с помощью системы формирования изображений, оснащенной объективом 2X и 10X с числовыми апертурами 0,40 и 0,95 соответственно. Захватывайте стек изображений 50Z с маркированной сетчатки в двух микрометрах кадров. Последовательно нажмите «Установить начальную фокальную плоскость», «Установить конечную фокальную плоскость», «Задать размер шага», выберите «Шаблон глубины», «Захват изображения» и «Z-Series», чтобы объединить все изображения в одно изображение в фокусе с помощью режима проекции и топографии. Затем сделайте снимки с использованием зеленой флуоресценции на 499 и 519 нанометров, красной флуоресценции на 591 и 618 нанометров и синей флуоресценции на 401 и 421 нанометрах. Последовательно выберите «Добавить новые поверхности», выберите «Настройки объема», выберите «Исходный канал», настройте отображение, настройте угол поверхности и снимок, чтобы импортировать конфокальные изображения Z-Stack в программное обеспечение для анализа, и реконструируйте изображения в трехмерном шаблоне. Прозрачность тканей всей сетчатки была увеличена после процедуры очищения тканей по сравнению с сетчаткой без очищения ткани. Сосудистая сеть сетчатки, меченная лектином томата, и паразиты сетчатки, меченные PDGFR-β, были видны как до, так и после очищения тканей, но фоновый шум был снижен после очищения тканей. Паразиты сетчатки наблюдались вдоль сосудистого дерева, демонстрируя градационное распределение от центральных к периферическим областям сетчатки. Трехмерные изображения Z-Stack с очищенной сетчатки показали паразитов, плотно обернутых вокруг сосудов сетчатки различного диаметра, с более сильным окрашиванием PDGFR-β в капиллярах.