Нокаут генов CRISPR-Cas9 на основе электропорации в клетках THP-1 и выделение клонов одиночных клеток

Моя исследовательская деятельность сосредоточена на понимании механизмов, которые делают макрофаги устойчивыми к инфицированию ВИЧ, вирусом, ответственным за пандемию СПИДа. В частности, мы сосредоточимся на активности фермента, называемого HT-1, который разрушает NTP, строительные блоки вирусных геномов. Но у этого фермента есть и другие активности, которые мы пытаемся выяснить.

Мы разработали протокол генной инженерии клеток THP1. Эти клетки являются хорошо зарекомендовавшим себя суррогатом для изучения человеческими макрофагами. Например, репликация ВИЧ-1.

Эти клетки трудно трансфицировать, чтобы манипулировать содержанием белка. Поэтому мы устанавливаем методы манипулирования их геномом с помощью технологии CRISPR-Cas9. От проектирования SG РНК до валидации поликлональных и моноклональных популяций.

Наш протокол направлен на достижение высокой эффективности редактирования интересующего гена в клетках THP1, который будет электропорироваться предварительно собранными рибонуклеопротеиновыми комплексами, продуцируемыми энергетическими РНК нуклеазы Cas9. При таком подходе активность Cas9 ограничена во времени. Это снижает возможность генерации целевых эффектов, которые часто возникают при использовании векторов ленти.

И в этом случае действительно экспрессия Cas9 удлиняет время и поэтому может быть вредной для клетки. Для начала заполните каждую лунку 24-луночного культурального планшета 500 микролитрами среды RPMI 1640 без антибиотика и дополненной 20% термоинактивированной и отфильтрованной FBS. Поместите тарелку во влажный инкубатор на ночь.

Чтобы регидратировать сухие одиночные направляющие или sgRNA до конечной концентрации 100 микромолей, добавьте 10 микролитров TE-буфера на одну наномоль sgRNA. Ввергните раствор в течение 30 секунд и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи, чтобы обеспечить полную регидратацию. На следующий день для приготовления 30 микролярного рабочего раствора сгРНК сначала кратко гомогенизируйте 100 микролярный стоковый раствор сгРНК с помощью пипетки, затем разведите стебель в воде, свободной от нуклеазы.

Ввергните раствор в течение 30 секунд и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Разведите по одному микролитру каждого из трех, 30 микромолярных рабочих растворов sgRNA и 0,5 микролитра 20 микромолярного раствора Cas9 в 3,5 микролитрах ресуспензионного буфера R, чтобы собрать рибонуклеопротеины Cas9 sgRNA, добавьте соотношение один к девяти. Вортексируйте ненадолго и выдержите в течение пяти минут при комнатной температуре.

Для приготовления неотредактированного контроля добавьте 0,5 мкл 20 микролярного раствора Cas9 к 6,5 мкл ресуспензионного буфера R.Vortex на короткое время и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, добавьте к образцам пять микролитров ресуспензионного буфера R до достижения конечного объема 12 мкл на одно условие электропорации. Чтобы получить клетки THP-1 после подсчета клеток, соберите объем, эквивалентный 0,2 умножить на 10 в степени шести клеток THP-1 и центрифугируйте их при 336G в течение пяти минут при 20 градусах Цельсия, отасканируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах PBS. Снова центрифугируйте и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 12 микролитрах раствора рибонуклеопротеина.

Чтобы настроить систему электропорации, поместите пипетную станцию под шкафом биобезопасности и поместите внутрь шкафа электропориционную трубку, добавьте в электропориционную трубку три миллилитра буфера E из набора для электропорации. Включите устройство электропорации и с помощью сенсорного экрана установите параметры электропорации, напряжение 1,500 вольт. Продолжительность до 10 миллисекунд.

И число до трех. Оснастите электропорационную пипетку наконечником и отсадите 10 микролитров раствора рибонуклеопротеина THP-1. Вставьте пипетку в трубку для электропорации и нажмите кнопку «Пуск» на экране устройства электропорации.

Дождитесь появления сообщения о завершении и извлеките пипетку из пробирки. Перенесите клетки THP-1 в лунку предварительно нагретого 24-луночного планшета для культивирования и аккуратно гомогенизируйте образец. Поместите планшет обратно во увлажненный инкубатор и дайте клеткам спокойно отдохнуть в течение 72 часов.

После электропорации и подсчета клеток извлеките объем, эквивалентный 0,1 умножить на 10 в степень шести ячеек THP-1, в 1,5 миллилитровую пробирку. Центрифугируйте клетки при 336G в течение пяти минут при 20 градусах Цельсия и аспирируйте надосадочную жидкость перед тем, как снова суспендировать гранулу в 500 микролитрах PBS. Снова центрифугируем клетки, аспирируем как можно больше надосадочной жидкости, не нарушая гранулу и щелкаем, замораживаем гранулу.

Для экстракции геномной ДНК ресуспендируют гранулу с 50 микролитрами раствора для экстракции ДНК. Гомогенизируйте его и переложите весь объем в ПЦР-пробирку объемом 0,2 миллилитров. Сделайте трубку вихревой и кратковременно центрифугируйте ее в течение трех секунд.

Поместите трубку в термоамплификатор и нагрейте до 65 градусов Цельсия в течение 15 минут, а затем до 98 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем разбавьте извлеченную ДНК 90 микролитрами сверхчистой воды, сделайте вихрь и кратковременно центрифугируйте при 5000G в течение трех секунд. Разведите праймер для ПЦР в ультрачистой воде до конечной концентрации 10 мкмоль.

Приготовьте смесь для ПЦР в ПЦР-пробирке объемом 0,2 миллилитров. Поместите ПЦР-пробирки в термоамплификатор и запустите программу с заданными настройками. Для поликлональных отредактированных популяций в новой пробирке объемом 0,2 миллилитра.

Смешайте 17,5 микролитров ампликона ПЦР с двумя микролитрами буфера Е, чтобы получить конечный объем 19,5 микролитров. Вихревой раствор и центрифуга кратковременно, в качестве альтернативы, для скрининга клонов одиночных клеток смешивают продукты ПЦР из отредактированных и неотредактированных контрольных клеток в соотношении один к одному. Для формирования гетеродуплекса поместите трубки в термоамплификатор и запустите заданную программу.

После образования гетеродуплекса добавьте в пробирку 0,5 микролитра Т-семи эндонуклеаз одного раствора и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Чтобы подготовить образцы для гель-электрофореза, смешайте пять микролитров продуктов разложения эндонуклеазы Т7 или непереваренного продукта ПЦР с пятью микролитрами воды и двумя микролитрами шестого красителя, загрузите образцы и лестницу размеров в гель и запустите гель при напряжении 80 вольт в течение 45 минут. Опосредованное CRISPR Cas9 редактирование генов локуса EGFP привело к резкому снижению GFP-положительных клеток, достигнув более чем 90% к седьмому дню после электропорации.

К третьему дню после электропорации количество клеток уменьшилось вдвое из-за стресса, вызванного электропорацией, но полностью восстановилось к седьмому дню в полной среде RPMI. Т7-эндонуклеаза и гель-электрофорез Агарозы продемонстрировали потерю примерно 75 фрагментов пар оснований в отредактированных клетках, подтверждающих редактирование CRISPR сайта-мишени EGFP.