Получение сфероидов из различных хондроцитов в условиях низкой адгезии под действием силы тяжести и самодельных мини-биореакторов

Восстановление хряща при хронических заболеваниях суставов требует передовой клеточной терапии для эффективной регенерации поврежденных тканей. Этот протокол представляет собой пошаговый метод дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в сфероиды на основе хондроцитов, поддерживая применение тканевой инженерии и клеточной терапии. Восстановление хряща при хронических заболеваниях суставов требует передовой клеточной терапии для достаточной регенерации поврежденных тканей.

Этот протокол представляет собой пошаговый метод дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в сфероиды на основе хондроцитов, поддерживая применение тканевой инженерии и клеточной терапии. Основными проблемами являются минимизация экспрессии коллагена первого типа в клетках, полученных из iPSC, для предотвращения фиброзного хряща, создание условий для формирования зрелого хряща высокой линии, совершенствование методов 3D-культивирования для стабильности сфероидов и разработка масштабируемых подходов к получению клинических объемов клеточного материала. Протокол обеспечивает преимущество, используя ИПСК в качестве альтернативного источника хондроцитов, что позволяет осуществлять масштабируемую продукцию без инвазивных процедур.

Он обеспечивает лучшее поддержание фенотипа хондроцитов с помощью 3D-культивирования и имитирует естественное развитие хряща, в результате чего клетки очень похожи на нативные хондроциты с высокой экспрессией хрящеспецифичных маркеров. Разработка эффективных методов повышения зрелости и функциональности хондроцитов, полученных из ИПСК, обеспечения долгосрочной стабильности in vivo, создания фиброзированных трехмерных культуральных материалов и разработки масштабируемого производства клеточного материала для клинического применения. Для начала простерилизуйте ножницы в автоклаве при температуре 121 градус Цельсия при соотношении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 минут.

После того как ножницы высохнут, разрежьте центрифужные пробирки на кольца высотой от семи до восьми миллиметров. Теперь измельчите чашки Петри с низкой адгезией, необработанные или микробиологические на мелкие кусочки с помощью соответствующего дробильного инструмента. Растворите примерно один грамм частиц пластика в 10 миллилитрах хлороформа на ночь внутри вытяжного шкафа.

Проверьте вязкость жидкого пластикового раствора, чтобы убедиться, что он подходит для пипетирования. Если раствор слишком жидкий, добавьте от одного до трех граммов дополнительных пластиковых частиц. Если он становится слишком густым, разбавьте его примерно пятью миллилитрами хлороформа.

Поместите автоклавное пластиковое кольцо в центр 60-миллиметровой чашки Петри. Затем нанесите жидкий пластик внутрь кольца, чтобы получилась пластиковая ручка. Дайте посуде высохнуть без крышки в ламинарной вытяжке в течение двух-трех часов.

После сушки подвергните посуду воздействию ультрафиолета в течение 20 – 30 минут. Для начала приобретите модифицированные чашки Петри, содержащие пластиковые ручки. Через два дня после забора хрящей промойте кусочки хрящей в растворе Хэнка с помощью 60-миллиметровых чашек Петри.

Затем разрежьте хрящ на фрагменты диаметром примерно один-два миллиметра с помощью автоклавных ножниц. Перенесите кусочки хряща в 15-миллилитровую пробирку и расщепите их в 0,01% растворе коллагеназы второго типа в DMEM в течение восьми-12 часов в орбитальном виброинкубаторе. После разложения добавьте фрагменты хряща с DMEM и центрифугируйте пробирку при 300 G в течение 10 минут.

После удаления промывочного раствора повторно суспендируйте фрагменты в культуральной среде хондроцитов и высадите их на адгезивную колбу Т25, предварительно покрытую 0,1%-ным раствором желатина, и инкубируйте. Затем культивируют индуцированные плюрипотентные стволовые клетки в шестилуночных планшетах, предварительно покрытых матрицей, содержащей внеклеточные белки. Чтобы инициировать дифференцировку в сторону хондроцитарной линии, культивируют иПСК в среде А в течение первых двух дней.

На третий день замените среду А раствором, исключающим CHIR-99021 и ингибитор ро-киназы, сохраняя при этом все остальные компоненты без изменений. На 10-й день перенесите хондроцитоподобные клетки в среду В, созданную для облегчения хондрогенеза, затем расплавьте 1,5% аргары в микроволновой печи в течение примерно 60-90 секунд при мощности 700 Вт. После разжижения добавьте по 75 микролитров агарозы в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования клеточной суспензии и дайте ей затвердеть при комнатной температуре.

Далее добавьте по 150 микролитров DMEM в каждую лунку и выдержите тарелку в углекислотном инкубаторе не менее 12 часов. На 12-й день наблюдайте за фенотипическими изменениями, связанными с андрогенезом, чтобы приступить к инициации сфероида. Отделите клетки на 80% конфлюенции от планшета с помощью 0,05% раствора трипсина.

После добавления равных объемов DMEM с 10% FBS переложите клетки в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте при 200 G в течение пяти минут. Ресуспендируйте клетки в одном миллилитре среды B и перенесите их в колбу для клеточных культур площадью 75 квадратных сантиметров, предварительно покрытую 0,1% раствором желатина. Как только клетки достигнут 80% конфлюенции в виде монослоя, снова отделите их трипсином и сусуспендируйте в среде В. Теперь распределите клетки в 96-луночную пластину, покрытую 1,5% агарозой, с плотностью 100 000 клеток на лунку, вместе со 150 микролитрами среды В. Инкубируйте клетки минимум один день и максимум три дня до образования сфероидов.

Затем перенесите сфероиды из лунок с помощью одномиллилитрового наконечника для пипетки с обрезанным концом в 15-миллилитровую трубку. Дайте сфероидам отстояться в течение двух-трех минут и удалите надосадочную жидкость. Теперь погрузите сфероиды в только что размороженный, неразбавленный матричный раствор базальной мембраны, темперированный до четырех градусов Цельсия.

Через 30 минут центрифугируйте пробирку при 100 G в течение одной минуты, чтобы собрать сфероиды. Наконец, перенесите сфероиды в подготовленные мини-биореакторы и добавьте шесть миллилитров среды B. Поместите мини-биореактор в инкубатор с углекислым газом. После 19 дней дифференцировки 99% клеток экспрессировали хондрогенные маркеры агрекан, коллаген первого типа, коллаген второго типа и SOX9.

Хондросферы высокого качества были идентифицированы как хондросферы с экспрессией хондроцитарных генов не менее 90-95%, оцененных с помощью анализа экспрессии генов на 30-й день дифференцировки. Зрелые сфероиды демонстрировали последовательный морфогенез, вырастая до типичного диаметра от одного до двух миллиметров через два месяца, при этом более крупные сфероиды демонстрировали центральные зоны с полостями или некрозом.