Оценка генов, связанных с аномальным ростом, гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток путем сочетания технологии CRISPR/Cas9 с подсчетом клеток

Область исследования – патогенез лейкемии. Мы стремимся идентифицировать гены, критически важные для аномальной пролиферации HSPC, в сочетании с CRISPR/Cas9 с анализами CCK-8, раскрывая их роль в онкогенезе и потенциал в качестве мишеней для лекарств.

Редактирование генов на основе CRISPR/Cas-9 обеспечивает простой и эффективный подход к достижению нокаута генов в ваших эукариотических клетках. Текущая экспериментальная задача заключается в дальнейшем повышении эффективности нокаута CRISPR/Cas-9.

Наш протокол использует мышей Cas-9 для снабжения клеток костного мозга консультативной экспрессией Cas-9, тем самым осуществляя вирусную доставку SGI в клетки, тем самым, значительно повышая эффективность эксперимента.

[Ведущий] Для начала получите бедренную и большеберцовую кости от усыпленной экспериментальной мыши. Перенесите бедренную и большеберцовую кости в ламинарный колпак сразу после удаления для сохранения стерильности. С помощью стерильного шприца объемом один миллилитр промыть полость костного мозга PBS, содержащим 2% FBS, для сбора клеток костного мозга. Пипетируйте клетки костного мозга вверх и вниз от 30 до 50 раз, чтобы рассеять их в отдельные клетки. Переложите клеточную смесь в 50-миллилитровую пробирку и хорошо перемешайте. Добавьте 10 микролитров клеточной суспензии в 40 микролитров буфера для лизиса эритроцитов и поместите его на лед на пять минут для лизирования эритроцитов. Затем добавьте 50 микролитров раствора Трипана синего. Хорошо перемешайте и посчитайте жизнеспособные клетки. Затем центрифугируйте клетки при 800 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия и аспирируйте надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируют клетки в концентрации один-два раза по 10 в степени шести клеток на миллилитр в костном мозге, предварительно стимулируя среду. И высейте 10 миллилитров суспензии в 10-сантиметровую посуду. Выдержать блюдо в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы собрать предварительно стимулированные клетки на следующий день, добавьте от пяти до 10 миллилитров PBS, содержащего 2% FBS, и энергично промойте пластину. Переложите клетки в свежую пробирку, а в ячейки добавьте трипановый синий. Подсчитайте жизнеспособные клетки в смеси. Далее центрифугируйте клетки при 800 G в течение 10 минут при комнатной температуре. После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в свежеприготовленном растворе для спензии в концентрации примерно 10 в степени шести клеток на миллилитр. Засейте по четыре миллилитра суспензии в каждую лунку шестилуночной пластины. Запечатайте пластину парапленкой и центрифугируйте ее при 1500 G в течение 90 минут при 32 градусах Цельсия. После центрифугирования аккуратно повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки, не меняя среду. Выдержите тарелку в течение четырех-шести часов. Для первой трансфекции отасуньте примерно три миллилитра надосадочной среды из каждой лунки в пробирку и добавьте такой же объем среды для предварительной стимуляции костного мозга. Если клетки случайно аспирированы, повторите этапы центрифугирования и повторного суспензирования, как описано ранее. Для вторичной трансфекции на следующий день удалите два-три миллилитра среды из каждой лунки и добавьте равный объем свежеразмороженного ретровирусного раствора вместе с соответствующими количествами гепы и полигрина. Центрифугируйте планшет при 1500 G в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия. После центрифугирования аккуратно повторно суспендируйте клетки и продолжайте инкубацию в течение четырех-шести часов. Теперь замените среду, как описано ранее, и выдерживайте в течение 24 часов. Промойте пластину PBS, содержащим 2% FBS, и соберите ячейки. Отфильтруйте клетки через сито 70 микрометров, прежде чем подсчитывать жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего. Далее центрифугируйте клетки при 800 G в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторно суспендируйте клетки в DMEM, содержащем 10% FBS и мышиный интерлейкин-3, интерлейкин-6 и фактор стволовых клеток. Центрифугируйте примерно от 0,5 до 1x10 в степени шести элементов при 800 G в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Храните клеточную гранулу при температуре -80 градусов Цельсия для экстракции геномной ДНК. Теперь прибавьте 1x10 к мощности четырех ячеек на лунку в 96-луночный планшет, получив шесть повторяющихся лунок на группу. Затем добавьте 100 микролитров стерильного PBS в окружающие лунки и инкубируйте до разных временных точек 0, 24, 48 и 72 часа. Отсасывайте среду в каждый момент времени и добавьте в лунки 110 микролитров среды, содержащей 1/10 объема раствора CCK-8. Выдерживайте смесь в течение одного часа. Наконец, измерьте поглощение на 450 нанометрах с помощью микропланшетного спектрофотометра. Нокаут Trp53 значительно увеличивал пролиферативную способность мышиных, гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток по сравнению с контрольной группой через 24, 48 и 72 часа по результатам анализа CCK-8. Эффективность редактирования Trp53 была оценена в 7,3% с использованием анализа TIDE. А секвенирование следующего поколения выявило мутации, происходящие на разных позициях в гене.