Пластырь-зажим для анализа одиночных эндолизосомальных везикул
4 апреля 2025 г.
В этом протоколе подробно описан метод прямого измерения активности ионных каналов на внутриклеточных везикулах с использованием ручной эндолизосомальной системы патч-зажимов. Мы проиллюстрируем метод, который заключается в увеличении эндолизосом и ручном выделении этих везикул. Такой подход гарантирует, что исследователи могут точно воспроизвести и применить процедуру.
Эндолизосомальные компартменты — это самые маленькие органеллы в клетках. Традиционные электрофизиологические методы не могут напрямую измерять изменения напряжения и тока. Эндолизосомный метод патч-зажима позволяет проводить прямые записи, что позволяет нам предварительно проводить исследования в ионных каналах.
Основная экспериментальная проблема заключается в том, что не все соединения эффективно увеличивают лизосомы. Идентификация подходящих клеток затруднена, и даже при идеальных лизосомах успешная регистрация ионных каналов не гарантируется. Мы разработали технику зажима эндолизосомного пластыря для обеспечения прямой электрофизиологической записи с эндолизосомальных мембран.
Этот прорыв позволил нам охарактеризовать ионные каналы, такие как TRPML и TPC, показав их роль в защите патогенов, дегенерации нейронов и метаболических нарушениях. Наш метод позволяет напрямую регистрировать лизосомальные ионные каналы, преодолевая ограничения по размеру целых клеточных патчей и зажимов, а также улучшая выбор везикул за счет интеграции методов на основе флуоресценции. Для начала установите капиллярную трубку в полярку.
Нажмите зеленую кнопку на клавиатуре. Ослабьте ручку зажима и снимите вытянутые пипетки с поляра. Затем поместите пипетки с вытянутым пластырем в держатель Microforge.
Осмотрите наконечники пипеток с помощью объектива с 35-кратным увеличением в сочетании с 15-кратным окуляром для общего увеличения 525-кратного. С помощью микроманипулятора поднесите патч-пипетки ближе к нити. Установите регулятор температуры на 80.
После включения нагревателя нажмите и удерживайте ножной переключатель в течение одной-двух секунд, чтобы подать короткий тепловой импульс. После полировки поместите полированные пипетки в герметичную коробку, чтобы предотвратить загрязнение пылью. Добавьте в камеру один миллилитр раствора для ванны.
Снимите крышку с обработанными ячейками HEK 293 с 24-луночной пластины. Перенесите крышку в камеру микроскопа. С помощью самодельной пластиковой иглы для наполнения изолирующей пипетки раствором пипетки.
Установите наполненную пипетку на передний конец коммутационного зажима. Под микроскопом с 40-кратным объективом и 10-кратным окуляром переместите изоляционную пипетку ближе к достаточно увеличенным эндосомам или лизосомам. Опустите изолирующую пипетку с помощью микроманипулятора до тех пор, пока она не коснется края плазматической мембраны.
Быстро двигайте пипеткой, чтобы оторвать небольшой кусочек мембраны. С помощью той же пипетки надавите на клетку с противоположной стороны, чтобы выдавить эндосомы/лизосомы примерно в двух микрометрах от клетки. Наполните только что отполированную патч-пипетку подходящим раствором для пипетки.
Установите пипетку на передний конец усилителя. Подайте на пипетку положительное давление от 20 до 50 миллибар и поддерживайте его, заблокировав клапан. Затем переместите наконечник пипетки в раствор для ванны и расположите его в центре поля зрения.
Применяйте повторяющиеся импульсы тока для определения сопротивления пипетки, сопротивления уплотнения и последовательного сопротивления. Контролируйте размер наконечника пипетки, формирование уплотнения и создание всей эндолизосомальной конфигурации. Быстро переместите пипетку близко к верхней части целевого пузырька.
Наблюдайте за движением или перекатыванием везикулы из-за потока жидкости из пипетки. Отрегулируйте напряжение смещения пипетки на ноль милливольт. Немедленно ослабьте положительное давление, чтобы втянуть везикулу к пипетке, образуя гигауплотнение в течение одной секунды.
Для регистрации всего везикулы используйте высоковольтный короткий импульс продолжительностью от двух до пяти миллисекунд, чтобы разрушить мембрану в точке контакта между пипеткой и органеллой. Установите напряжение от 500 до 1000 милливольт. Чтобы зарегистрировать ток, проведите эксперименты с эндолизосомальными зажимами напряжения с использованием широкого диапазона входных напряжений для оценки свойств мембраны.
Во время формирования гигасил реакция тока быстро снижалась, что свидетельствует об успешном установлении режима присоединения лизосомы. Повторное применение непрерывного входного напряжения регистрировало токи через эндолизосомальную мембрану, показывая базальные, активируемые агонистами и токи утечки.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол описывает метод прямого измерения активности ионных каналов на внутриклеточных везикулах с использованием ручной системы эндолизосомалного патч-клемп. Этот подход обеспечивает точное воспроизведение и применение процедуры исследователями.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Электрофизиология
- Клеточная биология
Фон
- Эндолизосомы - это самые мелкие органеллы в клетках.
- Традиционные электрофизиологические методы не могут напрямую измерять изменения их напряжения и тока.
- Метод эндолизосомалного патч-клемп позволяет проводить прямые записи.
- Идентификация подходящих клеток для этого метода может быть сложной.
Цель исследования
- Разработать метод для прямых электрофизиологических записей с эндолизосомалных мембран.
- Изучить ионные каналы, ранее недоступные с помощью традиционных методов.
- Решить проблемы, связанные с расширением лизосом для эффективных записей.
Используемые методы
- Ручная эндолизосомалная система патч-клемп.
- Расширение эндолиzosом для изоляции.
- Прямое измерение активности ионных каналов.
- Идентификация подходящих типов клеток для этого метода.
Основные результаты
- Успешное внедрение метода эндолизосомалного патч-клемп.
- Демонстрация прямых записей с эндолизосомалных мембран.
- Идентификация эффективных соединений для расширения лизосом.
- Понимание поведения ионных каналов в эндолизосомалных компартиментах.
Выводы
- Метод эндолизосомалного патч-клемп является ценным инструментом для изучения ионных каналов.
- Этот метод преодолевает ограничения традиционной электрофизиологии.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для изучения клеточных механизмов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Direct electrophysiological analysis of endolysosomal ion channels addresses a critical gap in early drug discovery by enabling functional target validation within disease-relevant intracellular compartments. This technique enhances predictive confidence for ion channel drug targets implicated in neurodegenerative and metabolic disorders, supporting risk-adjusted portfolio decisions. Its integration into discovery workflows accelerates the identification and mechanistic de-risking of novel therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of endolysosomal ion channel function in native vesicle membranes.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the role of specific channels in disease pathways.
- Facilitates functional validation of targets linked to neurodegeneration and metabolic disorders.
- Improves predictive confidence for advancing ion channel modulators in the pipeline.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for quantitative measurement of ion channel activity in isolated vesicles.
- Enables assay standardization and reproducibility through direct current and voltage recordings.
- Supports integration with fluorescence-based techniques for multiplexed readouts.
- Prepares validated systems for downstream compound screening and evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by targeting endolysosomal dysfunction in human cell models.
- Bridges discovery and preclinical validation by enabling direct measurement of therapeutic modulation effects.
- Supports translational biomarker development through quantifiable electrophysiological outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions endolysosomal patch-clamp as a bridge from early discovery through lead identification and preclinical validation for ion channel targets.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification for endolysosomal ion channels.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative electrophysiological data for assay development.
- Analytics: Provides direct current and voltage measurements to compare channel activity across conditions.
- Translational Research: Connects functional channel analysis to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse ion channel target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes direct vesicle analysis and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for ion channel programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of ion channel targets implicated in complex diseases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in manual patch-clamp electrophysiology and vesicle isolation.
- Demands high-resolution microscopy and precision micro-manipulation instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible data generation.
- May require adaptation for different cell types or disease models based on vesicle size and accessibility.
- Success depends on effective lysosome enlargement and vesicle selection, as supported by the protocol.
