Эквибиальное растягивающее устройство для конфокальной флуоресцентной микроскопии живых клеток с большим увеличением

Мы изучаем, как клетки реагируют и адаптируются к механическим раздражителям в физиологическом и патологическом контексте. Для этого с помощью растягивающего устройства мы прикладываем к клеткам внешние силы, в данном случае напряжение.

Мы выяснили, как клетки и клеточные ткани реагируют на специфические механические раздражители и как они механически реагируют на другие биологические сигналы.

Наше устройство для растяжения очень универсально по сравнению с другими, так как оно дает возможность растягивать клетки, культивируемые на полиакриламидных гелях различной жесткости, или проводить эксперименты по сжатию.

[Рассказчик] Для начала поместите кольца из ПММА на лист белой бумаги. Осторожно обойдите край пластины с покрытием PDMS с помощью лезвия, чтобы обеспечить чистый срез по всей окружности. С помощью пинцета приподнимите мембрану с одного края, затем аккуратно снимите ее большим пальцем, чтобы равномерно отделить половину мембраны от пластины. Пальцами равномерно распределите 96% этанол по всей верхней поверхности кольца из ПММА. Осторожно снимите мембрану PDMS с пластины, приподняв ее с ранее поднятого края. Затем поместите его симметрично на кольцо из ПММА, покрытое этанолом, не оставляя складок и избегая растяжения. Затем возьмите еще одно пустое кольцо из ПММА и поместите его поверх монтажного кольца. Используйте металлические зажимы, чтобы скрепить их вместе, закрепив мембрану PDMS между двумя кольцами. Поместите нижнюю половину натяжного кольца на монтажную опору. Поместите кольцо PDMS, зажатое на эластичное кольцо, и плотно нажмите на него до полного сидения, убедившись, что прокладка расположена правильно. Поместите круглые латунные грузики поверх образца. Далее поместите верхнюю половину металлического натяжного кольца сверху, совместив отверстия для винтов. Вставьте все винты и затяните их. Аккуратно разрежьте PDMS вокруг кольца с помощью лезвия. Накройте сборку чашкой Петри, чтобы защитить мембрану от пыли. Приготовьте одно разведение 250 000 флуоресцентных шариков размером 0,2 микрометра в PBS с использованием последовательного разведения. И поместите от 10 до 30 микролитров капли раствора гранул в центр PDMS. Дайте ему высохнуть при температуре не выше 40 градусов по Цельсию, чтобы избежать проблем со смешением после отверждения. Теперь установите растягивающее устройство на держатель предметного столика микроскопа и закрепите растягивающий штифт на микроскопе. Обильно нанесите смазку на круглую область столба. Установите подготовленное стрейчное кольцо на растяжную стойку и закрутите верхнюю крышку, чтобы запечатать сборку. Затем подключите заднюю часть блока управления вакуумом к источнику вакуума, а затем переднюю часть блока к стретч-стойке. Чтобы выполнить калибровку деформации, выберите область интереса, содержащую высокую плотность валиков и узнаваемые для пользователя комки валиков. Получите изображение в остальной части выбранного поля зрения и сохраните положение. Нанесите стретч при низком уровне вакуума минус 20 миллибар, вызывая движение во всех направлениях. Теперь перефокусируйтесь в плоскости Z и переместите рабочую область в направлениях XY, чтобы найти ту же область интереса и получить изображение в растянутом состоянии. Затем ослабьте напряжение и повторите шаги с более высоким уровнем вакуума. Храните полученные изображения в папке, упорядоченной по образцам. Имя, изображение эталонного шва, полученное без растяжения, как reference_str1, и изображения, растянутые при возрастающем уровне вакуума, как stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 и т. д. Чтобы количественно оценить деформацию, откройте MATLAB и загрузите код деформации геля. После установки параметров определите родительскую, а также пути к папкам эксперимента и запустите код. Затем откройте stretched_str1 в соответствии с кодом, а затем введите reference_str1. Теперь рассчитайте медианную матрицу деформации для каждого уровня вакуума. Повторив этот процесс по крайней мере для трех образцов, постройте график зависимости медианной матрицы деформации от уровня вакуума, чтобы получить калибровочную кривую. Чтобы покрыть кольцо PDMS, простерилизуйте его под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут. Под шкафом биобезопасности промойте пластину под колпаком стерильным ПБС. После аспирации все PBS используется для промывки пластины. Нанесите от 100 до 200 микролитров капли раствора в центр кольца. Нарисуйте перманентным маркером периметр капли с нижней стороны мембраны PDMS и инкубируйте ее. В день эксперимента промойте белок адгезии PBS. После трипсинизации клеток приступают к подсчету клеток. Засейте соответствующее количество клеток в небольшом объеме от 20 до 50 микролитров стандартной клеточной средой для стимулирования прикрепления и инкубируйте ее в инкубаторе с углекислым газом с контролем влажности. Через 20-30 минут аккуратно добавьте 500 микролитров среды поверх клеток и верните планшет в инкубатор, чтобы обеспечить дальнейшее распространение клеток. Для получения одного цикла высвобождения и получения изображений установите стретч-кольцо на предметный столик микроскопа, как было показано ранее. После обнаружения интересующей вас ячейки запишите ее положение и сделайте снимок предварительно растянутой ячейки. Примените желаемый уровень вакуума, соответствующий требуемой деформации подложки на основе калибровочной кривой, чтобы растянуть ячейку. Чтобы найти ячейку растяжения, сначала выполните повторную фокусировку в плоскости Z. Затем двигайтесь в направлениях XY, чтобы центрировать ячейку в поле зрения. Записывайте изображения в течение нужной продолжительности. Перейдите в исходное положение ячейки и активируйте режим сбора данных микроскопа, чтобы захват изображения начинался сразу после повторной фокусировки. Отпустите растяжку и быстро перефокусируйтесь вручную в плоскости Z. Захватывайте изображения освобожденной ячейки в течение необходимого времени, вручную регулируя фокус на протяжении всего процесса съемки. Для постобработки откройте Fiji и загрузите изображения, полученные в состоянии покоя и во время деформации. Используйте сопоставление шаблона плагина Fiji для выбора области ячейки для выравнивания. Калибровка обеспечила воспроизводимость и контроль над приложенной деформацией, подтвердив почти линейную зависимость между вакуумом и деформацией до 20%. Анализ радиального смещения показал изотропность и однородность деформации на мембране PDMS. Флуоресцентная визуализация клеток фибробластов при растяжении живых клеток выявила мембранные инвагинации при высвобождении растяжения, которые реабсорбировались в течение трех-пяти минут. Повторное растяжение неподвижных клеток позволило получить визуализацию в растянутом состоянии, предотвращая артефакты искусственного сворачивания. Мембрана PDMS с узорчатой сеткой облегчила мультимодальную визуализацию, позволив локализовать одни и те же клетки во флуоресценции и сканирующей электронной микроскопии. Клетки, сидящие на мягких гелях ПАА, покрытых фибронектином, образовывали фокальные спайки только при воздействии на определенные циклы циклического растяжения по сравнению с нерастянутыми клетками.