Захват распространенных хрупких участковых разрывов с помощью нативного γH2A. Х Чип

Наша роскошь сосредоточена на потере свиданий, роли общей нестабильности хрупкого участка в джайве в регенезисе опухоли. Попытайтесь определить вирусную подвижность в онкогеновых гиронных раковых клетках, которую можно использовать в терапевтических целях. В противном случае, технологии визуализации и секвенирования, такие как симпатия одиночных клеток и визуализация живых клеток, обеспечивают картирование геномной нестабильности в массе с высоким разрешением.

Области in vivo, включая шум, генетически модифицированные модели мышей и системы CRISPR вокруг нас, чтобы подробно изучить механизмы геномной нестабильности онкогенов. Долгосрочный интерес нашей лаборатории заключается в выявлении конкретных слабых мест в раковых клетках, которые можно стратегически лечить с помощью инфицированных препаратов, уделяя особое внимание минимизации вреда нормальным клеткам. Это включает в себя изучение генетических и эпигенетических уязвимостей для выявления нормальных терапевтических возможностей.

Для начала обработайте Т-клетки HEK 293 этилдеколином ДМСО и гидроксимочевиной в трех разных планшетах в течение 24 часов. После двукратной промывки клеток PBS центрифугируйте их при 500 G четыре, пять минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах свежеприготовленного холодного буфера А, и выиграйте на льду от пяти до 10 минут.

Наблюдайте за прогрессированием лизиса под световым микроскопом, чтобы подтвердить полный лизис клеток. После лизиса центрифугируйте клеточную суспензию при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и снова суспендируйте ядра в 500 микролитрах холодного буфера A.Centrifuge, а также повторно суспендируйте интактные ядра 100 микролитрами буфера микрококковой нуклеазы путем пипетирования от пяти до 10 раз. Сразу же добавьте в образцы заранее определенное количество микрококковой нуклеазы.

Поместите трубки на вращатель на пять минут при температуре 37 градусов Цельсия. Немедленно верните трубки в лед и добавьте ЭДТА, чтобы завершить пищеварение. После вортекса добавьте 500 микролитров буфера B и пипеткой вверх и вниз для перемешивания.

Инкубируйте трубку на льду в течение пяти минут, чтобы растворить белки. Чтобы гранулировать нерастворимый материал, центрифугируйте образцы на максимальной скорости в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите прозрачную надосадочную жидкость в новые пробирки объемом 1,5 миллилитров, помеченные как нативная хроматиновая фракция.

Чтобы проверить фрагментацию хроматина, внесите 10 микролитров надосадочной жидкости в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Смешайте надосадочную жидкость с 20 микролитрами дистиллированной воды и 30 микролитрами фенола хлороформа изоамилового спирта. После энергичного вортекса центрифугируйте пробирки при температуре 20 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и наблюдайте за тремя отдельными слоями: прозрачным верхним слоем, белым средним слоем и желтым нижним слоем.

Осторожно перенесите 20 микролитров верхней водной фазы, содержащей ДНК, в свежую пробирку. Разделите очищенную ДНК в 1,5%-ном агарозном геле на 30 минут при напряжении 100 вольт. Визуализируйте паттерны пищеварения, убедившись, что размер фрагментов хроматина в основном составляет от 200 до 1000 пар оснований.

Перенесите по 20 микролитров расваренного хроматина в каждую пробирку, содержащую 180 микролитров элюирующего буфера. Пометьте пробирки как входные образцы и храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия. Добавьте 400 микролитров переваренного хроматина в еще одну 1,5-миллилитровую пробирку для иммунопреципитации хроматина, или чип.

Перенос гамма-антител H2 AX в образец, обработанный ДМСО, этилдеколином и обработанный гидроксимочевиной. Поместите трубки на вращатель при температуре четыре градуса Цельсия на пять часов, а лучше на ночь. Между тем, с помощью широких наконечников отверстий залейте 100 микролитров шариков магнитного белка AG класса чипа в новую 1,5-миллилитровую пробирку.

Поместите трубку на магнитную подставку на одну минуту, затем осторожно слейте жидкость. Далее повторно суспендируйте шарики в одном миллилитре PBS, содержащем 0,5% BSA. Вращайте трубку на четыре градуса Цельсия в течение четырех часов.

Поместите трубку обратно на магнитную подставку на одну минуту и выбросьте надосадочную жидкость. После второй промывки повторно суспендируйте предварительно закодированные шарики в 100 микролитрах буфера В. Добавьте 25 микролитров предварительно закодированной магнитной суспензии в каждую пробирку с образцом чипа. Вращайте трубки на четыре градуса Цельсия в течение двух часов, затем поместите трубки с чипами на магнитную подставку и подождите, пока шарики прикрепятся к боковой стороне трубки и раствор станет прозрачным.

Выбросьте прозрачную надосадочную жидкость, не повреждая магнитные шарики. Суспензируйте бусины в одном миллилитре буфера для стирки и вращайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут. Поместите трубки обратно на магнитную подставку и подождите, пока раствор станет прозрачным, прежде чем выбрасывать буфер для промывки.

После окончательной промывки кратковременно центрифугируйте пробирки при 400 G в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить остатки жидкости. Поместите пробирки обратно на магнитную подставку и осторожно удалите остатки жидкости со дна пробирки. После проверки эффективности снижения антител на чипе, используя вестерн-блоттинг, добавьте 50 микролитров элюирующего буфера к каждому из оставшихся образцов чипа.

Поместите трубки на термомиксер и встряхивайте в течение 15 минут при комнатной температуре. Поместите пробирки на магнитный держатель на одну минуту и соберите элюит в новые пробирки. Добавьте 100 микролитров элюирующего буфера в каждый образец элюирования чипа и 180 микролитров элюирующего буфера в каждый входной образец.

Затем добавьте 200 микролитров фенола, хлороформа, изоамилового спирта в каждый образец и энергично перемешайте пробирки. После центрифугирования образцов осторожно перенесите верхний водный слой в пробирки, содержащие 19 микролитров трех моляров ацетата натрия и два микролитра раствора гликогена. Перемешивайте, вортексируя трубки.

Добавьте 500 микролитров 100% этанола в каждый образец, и тщательно перемешайте. Поместите пробирки при температуре минус 20 градусов Цельсия на два часа или на ночь, чтобы ДНК выпала в осадок. Затем центрифугируйте пробирки перед тем, как отбросить надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулу в одном миллилитре 70% этанола.

После того, как остаточный этанол будет удален центрифугированием, гранулы ДНК высушают на воздухе в течение двух-трех минут, прежде чем повторно суспендировать их в 400 микролитрах TE-буфера. Более высокие концентрации микрококковой нуклеазы приводили к более обширному расщеплению хроматина, что приводило к преобладанию мононуклеосомных фрагментов. Напротив, при более низких концентрациях микрококковых нуклеаз большинство фрагментов хроматина были больше, часто превышая один килограмм основания.

Уровни гамма-H2 AX были значительно повышены в клетках, подвергшихся репликационному стрессу, обработанных этилдеколином, по сравнению с контрольной группой, обработанной ДМСО, как показано во входных образцах как для нативного чипа, так и для сшитого чипа.