Механическое картирование сфероидов с использованием спектроскопии Бриллюэна

Мы используем спектроскопию Бриллюэна для неинвазивной оценки клеточной механики и понимания роли механобиологии в прогрессировании заболеваний. Неинвазивные технологии, такие как спектроскопия Бриллюэна, позволяют нам характеризовать механику в трёх измерениях, но без нарушения образца. Для начала предварительно обработайте колодцы пластины микроколодца, добавив в каждую скважину 500 микролитров раствора для промывания против прилизания.

Центрифугуйте пластину при 1 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре. После удаления пузырьков воздуха удалите раствор для промывания против прилипания из колодцев. Далее добавьте по миллилитру PBS в каждую лунку и полностью аспирируйте.

После повторного промывания PBS определите количество клеток на сфероид и количество сфероидов в геле согласно экспериментальной конструкции. Пеллетируйте клетки и суспензируйте их в один миллилитр добавленного DMEM. Затем добавьте один миллилитр этой суспензии в одну из ямоч пластины микроколодца и хорошо перемешайте.

Центрифугуйте пластину при 100 г в течение трёх минут при комнатной температуре. Осмотрите пластину микроколодца под микроскопом, чтобы подтвердить равномерное распределение клеток и то, что они осели на дне колодцев. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 24 часов, чтобы обеспечить образование сфероидов.

Чтобы собрать сфероиды, аккуратно и медленно удаляйте культурную среду, не беспокоя сфероиды. Отрежьте наконечник пипетки с покрытием PBS/FBS, чтобы расширить отверстие, и добавьте 500 микролитров PBS в каждую яму, чтобы вытеснить сфероиды. Соберите PBS, содержащие сфероиды, в трубку.

Затем перенесите 50 микролитров сфероидной суспензии в одну из 96-ядровой пластины. Для облегчения подсчёта нарисуйте крест на дне скважины с помощью перманентного маркера и подсчитайте количество сфероидов в этом объёме под микроскопом. Используйте уравнение для вычисления общего количества сфероидов.

Откройте программу SpectraLok и дождитесь, пока все подключённые устройства будут обнаружены. Затем выберите камеру спектрометра. Установите акриловый куб на держатель образцов микроскопа так, чтобы прозрачная сторона была обращена к объективу.

Опустите объектив как можно ниже и центрируйте куб под ней. Убедитесь, что оптический путь в микроскопе настроен так, чтобы камера спектрометра была экспонирована, повернув селектор вращающегося порта L.In окно камеры SpectraLok, установите время экспозиции сенсора на 500 миллисекунд и программное усиление на 100. Нажмите «Захват» и медленно поднимите объектив вверх.

Продолжайте поднимать хрусталик, пока пики Бриллюэна не станут видимы и их интенсивность не стабилизируется, что указывает на то, что фокусное пятно расположено внутри акрилового куба. Теперь откройте окно управления Pump Killer, или PK. Увеличите один из самых ярких ордеров Бриллюэна и регулируйте положение привода давления шагами в 100 микрометров, нажав кнопку move rel, чтобы минимизировать пиковую интенсивность Рэлея.

Если сигнал Релея увеличивается, нажмите «Назад», чтобы изменить направление корректировки. После снижения пика интенсивности Рэлея тонко настройте давление эталона меньшими шагами по 10 микрометров. В окне камеры приблизьте один из заказов Brillouin.

Нажмите S, чтобы визуализировать полосы, через которые LUT применяется к изображению камеры. Откройте окно настроек и нажмите Quick Calibrate, чтобы автоматически пересчитать оптимальный горизонтальный смещение полос. После проверки выравнивания полос отрегулируйте оси линз коллиматора, чтобы максимизировать эффективность связи света от Pump Killer к спектрометру.

Затем откройте окно Spectrum и нажмите Unwrap, чтобы получить Spectrum. В однородном акриловом кубе стремитесь к полному подавлению сигнала Рэлея и корректируйте до тех пор, пока сигнал Бриллюэна не станет чётко виден. Чтобы сохранить оптимизированные параметры, нажмите «Обновить все», а затем «Сохранить всё» в окне управления PK.

Наконец, в главном окне нажмите «Сохранить в разделе ввода/вывода файла», чтобы сохранить конфигурацию. После открытия программного обеспечения для сканирования установите стеклянную чашу Петри с образцом гидрогеля сфероида вместо акрилового куба. Снимите крышку чашки Петри, добавьте достаточно среды для погружения геля и положите сверху защитную защиту, чтобы предотвратить движение геля.

Определите сфероид, сначала заблокировав лазерный луч. Переключите оптический путь микроскопа на окуляр и включите освещение белого света. Используя джойстик, вручную управляйте этапом сэмпла, чтобы найти и сфокусироваться на сфероиде.

Получите изображение сфероида в ярком поле и регулируйте яркость освещения, вращая колесо управления. Переключите оптический путь на R, чтобы экспонировать камеру микроскопа, и настройте время экспозиции по необходимости. Далее установите порт микроскопа на L и зафиксируйте фон, пока лазер всё ещё заблокирован.

Разблокируйте лазер и, в зависимости от желаемого соотношения сигнал/шум, выберите время экспозиции от 200 до 500 миллисекунд. Из неупакованного спектра выберите линейку Brillouin Peak Fitting. Скорректируйте пороговое значение примерно до половины пика интенсивности Бриллюэна и исключите любые пики Бриллюэна с амплитудой ниже порога.

Примените коррекцию длины волны к лазеру по всем выявленным парам пиков Бриллюэна. Наконец, выберите геометрию растрового сканирования, отрегулировав ширину и размер шага, и начните сканирование для записи измерений. Репрезентативные изображения сфероида мезенхимальных стволовых клеток, встроенного в гидрогель, показали чёткие карты сдвига Бриллюэна и ширины линии Бриллюэна, а также соответствующие изображения флуоресценции яркого поля, ядер и флуоресценции актиновых филаментов.

Карта смещения частоты Бриллюэна низкого разрешения была сегментирована на гелевые и сфероидные области на основе контура, обведённого вручную с изображения яркого поля. Неоднозначные пиксели, возникшие в результате понижения дискретизации, были исключены из анализа, а для области геля и сфероидов были созданы прозрачные бинарные маски для извлечения значений BFS. Сравнение карт BFS высокого и низкого разрешения показало, что отбор проб кернов даёт средние значения BFS, сопоставимые с высокоразрешающими сканами, что свидетельствует о последовательных измерениях механики объёма сфероидов.

Наш протокол предоставит платформу, позволяющую исследователям изучать многие заболевания, связанные с механобиологией. Будет интересно посмотреть, являются ли изменения в сдвиге Бриллюэна, коррелирующие с механическими свойствами клеток, эффективными маркерами стадий прогрессирования заболевания. Мы оценим, как лечение лекарствами влияет на сфероидную механику на протяжении временных масштабов, имитирующих прогрессирование болезни.