Идентификация функционально значимых сайтов интеграции лентивирусов в библиотеке клеток инсерционного мутагенеза

Мы проводим исследования в области функциональной геномики с акцентом на идентификацию и характеристику функциональных элементов в геноме человека. Наш основной интерес заключается в изучении тех частей генома, которые еще не были хорошо распределены, чтобы лучше понять их потенциальную роль и то, как они могут повлиять на биологию и болезни человека. Современные инструменты обратной генетики имеют некоторые ограничения, такие как неспецифические эффекты и высокая стоимость создания сложных библиотек SSI или SGI.

Еще одна проблема заключается в том, что этот метод может быть нацелен только на выделенные элементы генома, оставляя большую часть генома малоизученной. Разработанный здесь протокол предлагает новый подход к идентификации ранее неизвестных геномных элементов, включая новые функциональные экзоны как в белках, кодирующих белки, так и в длиннокодирующих глазах. Для начала используйте геномную ДНК, выделенную из библиотеки клеток инсерционного мутагенеза на основе лентивируса, в качестве матрицы для линейной ПЦР в реакции объемом 50 микролитров. Тогда.

добавьте другие необходимые реагенты, показанные здесь, в пробирку для ПЦР. Выполните 50 циклов линейной ПЦР в стандартном амплификаторе в заданных условиях ПЦР. Переложите продукты ПЦР в новую чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Продукты ПЦР тщательно перемешать с 10 микролитрами магнитных шариков биотин-стрептавидина и выдержать смесь в течение двух часов при комнатной температуре, встряхивая при 400 об/мин в металлической ванне. Затем с помощью магнитной подставки соберите бусины и осторожно удалите надосадочную жидкость. Промойте бусины с 300 микролитрами связующего или буфером для стирки шесть раз, выбрасывая надосадочную жидкость после каждой стирки.

Для синтеза второй цепи ресуспендируйте гранулы в реакционном объеме 24 микролитра, содержащем буфер фрагментов Кленоу, смесь DNTP и праймер P5N6, в ПЦР-пробирке. Предварительно инкубируйте смесь при температуре 15 градусов Цельсия в течение 20 минут в термоциклере для ПЦР, затем добавьте в реакционную смесь две единицы фрагмента Кленова. Инкубируйте смеси в ПЦР-амплификаторе в заданных условиях.

Затем переложите продукты ПЦР в новую чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Используйте магнитную подставку, чтобы захватить бусины и выбросить надосадочную жидкость. После этого аккуратно промойте шарики 300 микролитрами дистиллированной воды без ДНКазы и РНКазы при температуре четыре градуса Цельсия.

Соберите бусины и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте шарики в реакционном объеме 25 микролитров для ПЦР, содержащем Taq-буфер, Taq-ДНК-полимеразу, праймер P5, смесь DNTP и праймер 3-LTR_Nest в ПЦР-пробирке. Проведите ПЦР в амплификаторе с настройками, показанными здесь.

Используйте пять микролитров продуктов ПЦР в качестве шаблона для следующего раунда ПЦР-реакции с праймером Illumina P5 и праймером Illumina P73-LTR. Проводят ПЦР в амплификаторе в заданных условиях. Затем переложите продукты ПЦР в чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Уравновесив бусины от двух до восьми градусов Цельсия до комнатной температуры в течение 30 минут, тщательно перемешайте бусины, переворачивая или вортекся. Пипетка в 1,2 раза больше объема шариков в чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте продукты ПЦР в бусины и тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз.

Инкубируйте шарики, чтобы ДНК могла с ними связаться. Затем поместите образцы на магнитную подставку и удалите надосадочную жидкость, как только раствор станет прозрачным. Теперь промойте шарики 200 микролитрами 80% этанола.

Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 секунд и удалить надосадочную жидкость. Высушите шарики на воздухе при комнатной температуре при открытой крышке в течение примерно пяти минут. Теперь снимите трубку с магнитной подставки.

Добавьте 22 микролитра дистиллированной воды без ДНКазы и РНКазы. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз, и дайте настояться при комнатной температуре в течение двух минут. Поместите трубку обратно на магнитную подставку до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

Затем перелейте 21 микролитр надосадочной жидкости в чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Для измерения концентрации с помощью флуориметра готовят рабочий раствор, смешивая реагент и буфер в соотношении один к 200. Смешайте 10 микролитров стандартного одного и 10 микролитров стандартных двух, каждый со 190 микролитрами рабочего раствора, для приготовления пробирных стандартов.

Аккуратно перемешайте смеси в течение двух-трех секунд. Далее готовят пробу анализа, смешивая один микролитр очищенных продуктов ПЦР со 199 микролитрами рабочего раствора. Аккуратно перемешайте смесь в течение двух-трех секунд.

Инкубируйте эталоны и образцы в течение двух минут при комнатной температуре, защищая их от света, затем включите флуориметр. Выберите программу высокочувствительного анализа двухцепочечной ДНК в главном меню. Для калибровки вставьте единицу стандарта в машину и нажмите кнопку считывания эталона, чтобы измерить первый эталон.

Затем вставьте второй стандарт и нажмите кнопку чтения стандарта, чтобы измерить второй эталон. Для измерения образца нажмите кнопку запуска образцов, чтобы перейти на страницу измерения образца. Вставьте каждую пробирку, содержащую образец анализа, и нажмите кнопку считывания пробирки, чтобы получить концентрацию.

В образце низкого качества доминирующий пик около 83 пар оснований указывает на загрязнение димером адаптера. В отличие от этого, высококачественная библиотека NGS отображает основные пики между 150 и 1500 парами оснований, что отражает профиль успешной библиотеки.