Выделение и поглощение дендритными клетками малых внеклеточных везикул из Echinococcus granulosus

Наше исследование сосредоточено на характеристике внеклеточных везикул Echinococcus granulosus и их роли во взаимодействиях паразита и хозяина. Мы исследуем поглощение состава дендритными клетками хозяина и потенциальное влияние на иммуномодуляцию. Мы продемонстрировали, что E. granulosus EV поглощаются дендритными клетками, влияя на созревание и презентацию антигена. Мы также идентифицировали ключевые иммуномодулирующие и антигенные белки в грузе ВВ, которые могут влиять на взаимодействие паразита и хозяина и иммунные реакции.

Наш протокол оптимизирует культуру паразитов in vitro для увеличения производства малых ВВ, обеспечивает высококачественную изоляцию и интегрирует анализы дендритных клеток для изучения иммуномодуляции. Он может применяться как целиком, так и по частям. В наших будущих исследованиях будет изучено влияние ВВ E. granulosus in vivo на иммунные реакции, их потенциал в качестве компонентов вакцины и их влияние на дендритные клетки, микрофаги и иммунные модели этих клеток.

[Рассказчик] Для начала очистите брюшную поверхность усыпленной мыши с эвтанакокковой болезнью, используя 70% спирт. Хирургическим путем вскрывают брюшную полость для удаления развившихся метацестод с помощью ножниц и щипцов. Затем перенесите метацестодные массы в стерильную чашку Петри с помощью щипцов. При необходимости удалите соединительную ткань с помощью щипцов, чтобы освободить кисты из метацестодальных масс. Полученные метацестоды промыть дополненным PBS при четырех градусах Цельсия. Теперь приготовьте питательную среду с использованием всех необходимых компонентов и аккуратно перемешайте раствор путем инверсии. Переложите по пять миллилитров подготовленной питательной среды в каждую пробирку Лейтона. Добавьте паразитов в питательную среду и инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти дней, не меняя среду. Соберите питательную среду для паразитов из каждой пробирки Лейтона и переложите ее в 15-миллилитровую коническую пробирку. Центрифугируйте собранную среду при 300г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и переложите надосадочную жидкость в новую 15-миллилитровую коническую пробирку. Теперь центрифугируйте надосадочную жидкость при весе 2000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите полученный надосадочный агент в новую 1,5-миллилитровую пробирку с помощью пипетки. Центрифугируйте пробирку при 10 000 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить более мелкие клеточные остатки. С помощью пипетки перенесите надосадочную жидкость в пробирку, подходящую для ротора ультрацентрифуги. Отметьте маркером одну сторону трубки. И поместите трубку в ротор отмеченной стороной вверх. Центрифугируйте пробирки при 100 000 г в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Быстро слейте надосадочную жидкость и дайте трубке отдохнуть вверх дном в течение одной минуты. Промойте гранулу не менее чем тремя миллилитрами PBS, чтобы удалить загрязняющие белки. Повторно суспендируйте гранулу несколько раз с помощью пипетки вдоль всех поверхностей трубки, сосредоточившись на отмеченной стороне, где ожидается ее нахождение. После повторения ультрацентрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 30 микролитрах PBS. Переложите ресуспендированный образец в пробирку объемом 1,5 миллилитра и заморозьте внеклеточные пузырьки при температуре минус 80 градусов Цельсия для хранения. Опрыскайте этанол для усыпленной самки мыши CF-1 в возрасте от пяти до восьми недель перед помещением ее в капюшон для культуры тканей. Поместите мышь на доску для препарирования в положении лежа на спине. С помощью щипцов и ножниц для рассечения сделайте вертикальный Т-образный разрез над мочеиспускательным каналом и продлите его горизонтально до верхней части нижних конечностей. С помощью щипцов отделите кожу вдоль обеих задних конечностей, чтобы обнажить кости и ткани ног. Руками снимите кожу с каждой ноги после надавливания от лодыжки к животу, оттягивая кожу в противоположную сторону, оставляя обе ноги свободными от кожи. Теперь аккуратно удалите бедренную и большеберцовую кости с помощью ножниц и щипцов, убедившись, что они не сломаются. Закрепите кончик каждой кости щипцами. И разрежьте сухожилия, чтобы удалить мышечные фасции вокруг костей. Завершите очистку мышечной ткани бумажными салфетками. Поместите каждую удаленную кость в стерильную 50-миллилитровую пробирку, содержащую два миллилитра дополненной полной среды RPMI для удаления мусора. Выбросив средство, каждый раз дважды промойте кости 70% этанолом в течение пяти минут. Переложите промытые кости в стерильную чашку Петри и отрежьте двухкостные эпифизы с помощью острых ножниц для доступа к клеткам костного мозга. С помощью иглы 25-го калибра, прикрепленной к 20-миллилитровому шприцу, содержащему полную среду, осторожно промойте клетки костного мозга из каждой из четырех костей в стерильную чашку Петри. Затем аккуратно гомогенизируйте среду, содержащую ускользающий костный мозг, с помощью пипетирования, чтобы удалить костную соединительную ткань и клеточные комки. Перенесите образец в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров, пропустив клетки через стерильное 70-микрометровое полипропиленовое сетчатое фильтр для клеток для удаления соединительной ткани и костных остатков. Центрифугируйте клетки при 450 г в течение семи минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы гранула оставалась прилипшей к стенке трубки. После инкубации клеток в течение одной минуты при комнатной температуре ресуспендируйте их в 500 микролитрах буфера для лизиса эритроцитов и нейтрализуйте буфер для лизиса тремя миллилитрами полной среды. Центрифугируйте клетки при 450 г в течение семи минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах готовой среды. После фильтрации образца, как показано на рисунке, подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Добавьте 300 нанограмм на миллилитр рекомбинантной тирозинкиназы, связанной с FMS мышиной FMS, или FLT3L, в питательную среду. Поместите клетки в многолуночный планшет с концентрацией один умножить на 10 в степени шести клеток на миллилитр. Инкубируйте клетки в течение семи дней при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 5% углекислым газом. На третий день удалите по одному миллилитру среды из каждой лунки, не нарушая клетки, и замените его одним миллилитром предварительно подогретой свежей полной среды, дополненной 150 нанограммами на миллилитр рекомбинантного мышиного FLT3L. Внеклеточные везикулы, или ВВ, выделенные из личинковой стадии Echinococcus granulosus, были в основном небольшими ВВ размером от 50 до 200 нанометров, что подтверждено динамическим рассеянием света и просвечивающей электронной микроскопией. Дендритные клетки, полученные из костного мозга, продемонстрировали морфологическую дифференцировку в течение семи дней, прогрессируя от небольших круглых гемопоэтических клеток к звездчатым клеткам с цитоплазматическими расширениями. После одного часа инкубации дендритные клетки захватывали флуоресцентно меченные малые EV, которые колокализовались с молекулами MHCIII в эндосомально-лизосомальных компартментах, что было подтверждено конфокальной микроскопией.