Высокопроизводительные автоматизированные мультиплексные иммунофлуоресцентные анализы для трансляционных исследований

Мы разрабатываем наборы для быстрых и чувствительных мультиплексных иммунофлуоресцентных анализов. Цель здесь состоит в том, чтобы помочь исследователям профилировать различные типы клеток, появляющихся в тканях FFPE

Иммунофлуоресценцию обычно проводят с использованием меченных красителем или пероксидазой вторичных антител. Иммуногистохимия имеет тенденцию к низкому плексу. Вторичные антитела, меченные красителем, страдают от более низкого сигнала. Анализ усиления тирамидного сигнала трудоемк в оптимизации и занимает от нескольких часов до нескольких дней.

Маркеры анализов поставляются предварительно оптимизированными, и это значительно быстрее, чем при использовании других методов. Установка четырех маркеров занимает менее восьми часов, и еще около трех часов для каждых дополнительных четырех биомаркеров.

Возможность более быстрого выполнения мультиплексной иммунофлюоресценции позволит более широко применять пространственную протеомику и снизит барьер на пути к пониманию пространственного контекста ткани.

[Рассказчик] Для начала разморозьте все реактивы из набора при комнатной температуре. Храните конъюгаты антител, фермент амплификации, инициатор обмена и нейтрализатор обмена при температуре минус 20 градусов Цельсия до использования. Vortex – размораживающий разбавитель антител. Поместите разбавитель антител пипеткой в контейнер. Кратко центрифугируем и добавляем все антитела в 1 контейнер для окрашивания раствора антител. Добавьте в прилагаемый разбавитель антител в разведении от 1 до 100. Затем с помощью пипетки аккуратно перемешайте раствор, не допуская завихрения. Вихревой раствор предварительно амплификацией смешанного раствора после размораживания тщательно перемешать. Затем добавьте раствор в соответствующую емкость для смеси. Сделайте вихревой буфер для амплификации и смешайте пипетку с ферментом усиления. Разбавьте фермент амплификации в соотношении 1 к 10 в амплификационном буфере для создания амплификационного буфера. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки, не допуская завихрения. Затем вихревую и центрифугированную центрифугируют полученный ядерный противопятнящий раствор и разбавляют 1 к 100 в ультрачистой воде. Далее разбавьте флуоресцентные зонды 1 раствором в соотношении 1 к 20 в буфере зонда. Вставьте полную трубку с реагентом в прибор, чтобы можно было измерить объемы реагентов. Перейдите на вкладку «Настройка предметного стекла» в верхней части программного обеспечения для автоматического окрашивания, когда все реагенты будут готовы. Нажмите кнопку «Добавить исследование» и введите идентификатор исследования, название исследования и любые комментарии к исследованию. В разделе «Объем дозирования» выберите 150 микролитров и выберите «Удаление парафины за 4 этапа» в качестве метода приготовления. Если он недоступен в выпадающем списке, откройте меню Настройка протокола, отметьте для него нужный флажок и нажмите OK. После того, как исследование будет создано, нажмите на кнопку «Добавить слайд», расположенную в правой части экрана настройки слайда. Введите уникальное имя слайда в разделе Комментарии к слайду. Установите для параметра Тип ткани значение Проверить ткань в соответствующем поле. Затем выберите 150 микролитров для параметра «Объем дозирования» и установите режим окрашивания на «Одиночный» в левом раскрывающемся списке и «Рутинный» в правом раскрывающемся списке. В разделе Процесс выберите ИГХ и установите для параметра Маркер раствор для окрашивания антител. В разделе «Протоколы» в окне «Добавить слайд» выберите «Анализ окрашивания 1 для окрашивания», «* Удаление воска 4 этапа для подготовки» и «*HIER 20 минут с ER2 для окрашивания». Оставьте для параметра Протокол фермента звездочкой и нажмите кнопку Добавить слайд, когда все поля будут заполнены. После добавления всех слайдов закройте окно Добавить слайд и распечатайте этикетки слайдов, прикрепив каждую к соответствующему участку ткани. Загрузите каждый предметный предмет с маркировкой на лоток и положите покровную плитку поверх каждой секции салфетки. Вставьте лоток в прибор и выберите соответствующую автоокрашивающую машину в правой части экрана программного обеспечения. Убедитесь, что все три лотка для слайдов и вся информация о реагентах, включая сыпучие и подготовленные реагенты, видны. Убедитесь, что контейнеры с реагентами достаточно заполнены и что контейнеры для отходов имеют достаточный объем для завершения цикла. Затем нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать окрашивание и обеспечить своевременное удаление предметных стекол из автоматического окрашивателя после завершения процедуры. Поместите окрашенные стекла в буфер PBS и наклейте защитные стекла с помощью монтажного носителя. Визуализируйте предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа или сканера цельного предметного стекла с фильтрами, совместимыми с пробными красителями. Для проведения обменного анализа разморозьте обменный буфер при комнатной температуре. Храните обменный нейтрализатор и инициатор обмена при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к использованию. Подготовьте два контейнера для титрования реагентов и извлеките набор для обнаружения для использования во время протокола обмена. Вихревой буфер обмена. И пипеткой смешайте инициатор обмена. Приготовьте обменное решение в предназначенном для него контейнере, смешав необходимые объемы инициатора обмена и буфера обмена. Перемешивайте содержимое только с помощью пипетирования. Теперь соедините раствор флуоресцентного зонда 2 с разбавленным обменным буфером в соответствующей емкости. Вихревой смеси только буфера зонда и флуоресцентного зонда и пипетки смешивают конечный раствор. Поместите полную трубку с реагентами со всеми подготовленными реагентами на автоокрашиватель. Позвольте машине провести испытание погружением всех реагентов. После добавления слайдов установите маркер в положение *Negative. А для Preparation, HIER и Enzyme выберите опцию со звездочкой, так как для протокола обмена не требуется депарафинизация или извлечение антигена. Нажмите «Добавить слайд», когда закончите. После добавления всех слайдов закройте окно Добавить слайд и распечатайте этикетки для слайдов, которые будут прикреплены к каждому соответствующему участку ткани. Загрузите каждый предметный предмет на лоток и положите покровную плитку на каждый участок салфетки, прежде чем поместить лоток в автоматический окрашиватель. Теперь нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать забег. Изображения ядра тканевого микрочипа, полученные в течение двух раундов окрашивания с использованием протокола иммунофлуоресценции из восьми плексов, показали различные иммунные маркеры в каждом раунде, при этом успешная совместная регистрация изображений объединила оба раунда в единый композит. Визуализация тканей колоректального рака методом полного стекла позволила идентифицировать иммунные фенотипы на основе колокализации маркеров, включая регуляторные Т-клетки, истощенные Т-клетки и иммуносупрессивные макрофаги. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало совместную экспрессию CD3, CD4 и FoxP3 в регуляторных Т-клетках. PD1 и PDL1 в опухолевых и стромальных клетках. CD3, CD8 и PD1 в истощенных цитотоксических Т-клетках. А также CD 68 и PDL1 в иммуносупрессивных макрофагах. Сравнение иммуногистохимии по одному маркеру и одиночной или мультиплексной иммунофлюоресценции подтвердило качественное соответствие в характере окрашивания по всем маркерам. Окрашивание серийных срезов на различных типах тканей подтвердило устойчивые паттерны экспрессии иммунных маркеров с репрезентативными тканевыми ядрами, показав успешное окрашивание и минимальную вариабельность. Срезы миндалин, окрашенные в шести последовательных слайдах для CD8, продемонстрировали высокую воспроизводимость с почти идентичным распределением сигнала на всех изображениях. Количественная оценка плотности маркер-положительных клеток по типам тканей показала самую высокую плотность в миндалинах и лимфатических узлах и самую низкую в меланоме и толстой кишке.