Фенотипирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей на основе очистки, экспансии и проточной цитометрии
11 июля 2025 г.
В настоящем протоколе описан экономически эффективный метод очистки, расширения и определения характеристик высокогомогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (BMSC) мышей. Такой подход способствует приобретению больших количеств BMSC с высоким потенциалом пролиферации и дифференцировки, поддерживая модели мышей и продвигая доклинические исследования.
Наше исследование представляет собой недорогой метод очистки и расширения однородных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мыши. Это помогает исследователям получить достаточное количество высококачественных клеток с сильными способностями к росту и дифференцировке. Ключевой проблемой в исследованиях стволовых клеток костного мозга является разработка простого и эффективного протокола выделения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Этот метод позволяет мезенхимальным стволовым клеткам костного мозга расти латерально, избегая нарушений. Он использует третье пассирование, позволяет избежать дополнительных эффектов роста и поддерживает гемопоэтические клетки для поддержания здоровья и функции стволовых клеток.
[Инструктор] Для начала замочите усыпленную мышь в 75%, этаноле на пять минут. С помощью стерильных ножниц для вскрытия сделайте примерно один сантиметр разрез на задней конечности, рядом с ахилловым сухожилием. Затем выполните круговой разрез вокруг задней конечности, чтобы обнажить дистальный отдел большеберцовой кости. Отшелушивайте кожу от места разреза вверх к бедру, чтобы удалить кожу с обеих задних конечностей. Разрежьте вдоль подвздошной кости, чтобы отделить головку бедренной кости от тазобедренной кости. С помощью стерильного скальпеля удалите как можно больше сухожилий и мышц из большеберцовой и малоберцовой костей, чтобы облегчить последующее покраснение. Верните очищенные кости в чашку, содержащую PBS с 2% пенициллином и стрептомицином, прежде чем переместить их в стерильный капюшон. Возьмите шприц объемом 50 миллилитров и прикрепите к нему иглу, которая идет в комплекте со шприцем. Наполните шприц 20 миллилитрами альфа-МЭМ-среды и замените иглу на ту, которая идет в комплекте с одномиллилитровым шприцем. В стерильном капюшоне с помощью ножниц отрежьте оба конца отделенной бедренной кости или большеберцовой кости. Теперь вставьте иглу в кость на краю разреза и промойте костный мозг в 100-миллиметровую чашку для клеточной культуры, содержащую полную среду альфа-MEM. Продолжайте промывание до тех пор, пока кость не станет заметно бледной, что указывает на успешное извлечение костного мозга. Делайте пипетки вверх и вниз 40 раз с помощью наконечника для дозатора объемом в один миллилитр, чтобы диспергировать любые клеточные агрегаты. Теперь отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 40 микрометров в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, чтобы удалить мусор, фрагменты тканей и недиспергированные комки. Отрегулируйте общий объем до 15 миллилитров с полной средой альфа-МЭМ и перелейте отфильтрованную клеточную суспензию в 100-миллиметровую чашку для культур. Держите чашку обеими руками и аккуратно поверните ее 15 раз движением в форме восьмерки, чтобы равномерно распределить ячейки по чашке. Наконец, поместите чашку для культивирования в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом и заквашивайте на пять дней. На этом рисунке показана морфологическая прогрессия стромальных клеток костного мозга от первоначального извлечения до третьего пассажа в культуре. Свежеизвлеченные клетки костного мозга оказались преимущественно мононуклеарными, с разбросанными каплями жира, видимыми по всему полю. К пятому дню культивирования веретенообразные клетки начали проявляться и достигли примерно 60-80% слияния, продолжая увеличиваться в плотности к седьмому дню. С первого по третий пассаж стромальные клетки костного мозга сохраняли веретенообразную или веретенообразную морфологию, образовывали прозрачный монослой с взаимосвязанными колониями и не проявляли признаков апоптоза, таких как цитоплазматическая зернистость или ядерная фрагментация. Проточная цитометрия подтвердила, что CD29, CD44 и Sca-1 были высоко экспрессированы в стромальных клетках костного мозга. Экспрессия маркеров CD31 и CD45 эндотелиальных и кроветворных линий была незначительной. Количественное определение маркеров также подтвердило высокие уровни экспрессии CD29, CD44 и Sca-1 по сравнению с CD31 и CD45.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен экономически эффективный метод очистки и экспансии высокооднородных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга мышей. Данный протокол не только упрощает процесс выделения, но и повышает пролиферативный и дифференцировочный потенциал полученных МСК, что способствует развитию доклинических исследований с использованием мышиных моделей.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Клеточная биология
- Исследования стволовых клеток
- Доклинические модели
Теоретическая часть
- Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга играют важнейшую роль в регенеративной медицине.
- Гомогенные популяции МСК костного мозга необходимы для получения достоверных результатов экспериментов.
- Требуются экономически эффективные протоколы для обеспечения более широкого доступа к исследованиям.
Используемые методы
- Методы экстракции и культивирования костного мозга.
- Мышиная модель для получения БСКМ (BMSCs).
- Проточная цитометрия для характеристики клеток.
Основные результаты
- Данный протокол позволил получить БСКМ с высоким потенциалом к росту и дифференцировке.
- БСКМ сохраняли характерную веретеновидную или веретеновидную морфологию на протяжении всех пассажей.
- Проточная цитометрия подтвердила высокую экспрессию маркеров стволовых клеток CD29, CD44 и Sca-1.
Выводы
- Данное исследование успешно демонстрирует надежный метод выделения БСКМ, который может быть использован в дальнейших исследованиях.
- Полученные результаты имеют значение для повышения воспроизводимости и эффективности применения стволовых клеток в биологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Надежная очистка и экспансия гомогенных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга мыши имеют решающее значение для разработки доклинических моделей и трансляционных исследований. Данный протокол позволяет стабильно получать высококачественные МСК с подтвержденным фенотипом, что способствует надежной валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Стандартизированные рабочие процессы получения МСК костного мозга снижают биологическую вариабельность, повышая прогностическую достоверность в рамках портфелей НИОКР.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Обеспечивает воспроизводимое выделение БСК-КМ для изучения сигнальных путей на основе выдвинутых гипотез.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней, обеспечивая получение гомогенных, хорошо охарактеризованных популяций клеток.
- Снижает механистическую неопределенность в релевантных для заболеваний моделях in vitro.
- Облегчает отбор перспективных кандидатов в портфеле за счет обеспечения стабильности биологических исходных материалов для скрининга.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных популяций БСК для последующей разработки анализов.
- Повышает воспроизводимость анализа и надежность количественных данных за счет фенотипической валидации.
- Позволяет масштабировать экспансию БСК для платформ высокопроизводительного скрининга.
- Обеспечивает достоверность оценки соединений за счет минимизации гетерогенности клеточной популяции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует доклиническим моделям заболеваний за счет предоставления валидированных популяций стволовых клеток.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации благодаря стабильному качеству клеток.
- Снижает риски трансляционных исследований путем подтверждения потенциала дифференцировки и пролиферации.
- Способствует согласованию биомаркеров с помощью фенотипирования методом проточной цитометрии.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол объединяет этапы раннего поиска и разработки доклинических моделей, создавая основу для идентификации ведущих соединений и трансляционных исследований.
- Поисковая биология: Обеспечивает строгую проверку гипотез и выяснение путей передачи сигналов с использованием гомогенных БСК.
- Скрининг: Предоставляет фенотипически валидированные клетки, готовые к анализу, для воспроизводимых рабочих процессов скрининга.
- Аналитика: Использует проточную цитометрию для получения количественных данных об экспрессии маркеров для сравнения условий.
- Трансляционные исследования: Связывает поисковые и доклинические исследования с помощью валидированных популяций мультипотентных стволовых клеток.
- Корпоративное повторное использование: Устанавливает стандартизированный масштабируемый протокол для многократного применения в программах НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает биологические риски на ранних этапах исследований.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов с использованием BMSC.
- Стратегическая ценность: способствует принятию обоснованных решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и капиталоэффективному развитию портфеля.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков, предоставляя надежные входные данные доклинических моделей.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы в стерильных условиях и опыт анализа методом проточной цитометрии.
- Необходим доступ к инфраструктуре для культивирования клеток и аналитическому оборудованию.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения единообразия подготовки и фенотипирования клеток.
- Метод применим к различным линиям мышей, однако может потребовать оптимизации для других видов.
- Выход и гомогенность продукта зависят от точного соблюдения этапов протокола.
