Фенотипирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей на основе очистки, экспансии и проточной цитометрии

Наше исследование представляет собой недорогой метод очистки и расширения однородных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мыши. Это помогает исследователям получить достаточное количество высококачественных клеток с сильными способностями к росту и дифференцировке. Ключевой проблемой в исследованиях стволовых клеток костного мозга является разработка простого и эффективного протокола выделения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Этот метод позволяет мезенхимальным стволовым клеткам костного мозга расти латерально, избегая нарушений. Он использует третье пассирование, позволяет избежать дополнительных эффектов роста и поддерживает гемопоэтические клетки для поддержания здоровья и функции стволовых клеток.

[Инструктор] Для начала замочите усыпленную мышь в 75%, этаноле на пять минут. С помощью стерильных ножниц для вскрытия сделайте примерно один сантиметр разрез на задней конечности, рядом с ахилловым сухожилием. Затем выполните круговой разрез вокруг задней конечности, чтобы обнажить дистальный отдел большеберцовой кости. Отшелушивайте кожу от места разреза вверх к бедру, чтобы удалить кожу с обеих задних конечностей. Разрежьте вдоль подвздошной кости, чтобы отделить головку бедренной кости от тазобедренной кости. С помощью стерильного скальпеля удалите как можно больше сухожилий и мышц из большеберцовой и малоберцовой костей, чтобы облегчить последующее покраснение. Верните очищенные кости в чашку, содержащую PBS с 2% пенициллином и стрептомицином, прежде чем переместить их в стерильный капюшон. Возьмите шприц объемом 50 миллилитров и прикрепите к нему иглу, которая идет в комплекте со шприцем. Наполните шприц 20 миллилитрами альфа-МЭМ-среды и замените иглу на ту, которая идет в комплекте с одномиллилитровым шприцем. В стерильном капюшоне с помощью ножниц отрежьте оба конца отделенной бедренной кости или большеберцовой кости. Теперь вставьте иглу в кость на краю разреза и промойте костный мозг в 100-миллиметровую чашку для клеточной культуры, содержащую полную среду альфа-MEM. Продолжайте промывание до тех пор, пока кость не станет заметно бледной, что указывает на успешное извлечение костного мозга. Делайте пипетки вверх и вниз 40 раз с помощью наконечника для дозатора объемом в один миллилитр, чтобы диспергировать любые клеточные агрегаты. Теперь отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 40 микрометров в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, чтобы удалить мусор, фрагменты тканей и недиспергированные комки. Отрегулируйте общий объем до 15 миллилитров с полной средой альфа-МЭМ и перелейте отфильтрованную клеточную суспензию в 100-миллиметровую чашку для культур. Держите чашку обеими руками и аккуратно поверните ее 15 раз движением в форме восьмерки, чтобы равномерно распределить ячейки по чашке. Наконец, поместите чашку для культивирования в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом и заквашивайте на пять дней. На этом рисунке показана морфологическая прогрессия стромальных клеток костного мозга от первоначального извлечения до третьего пассажа в культуре. Свежеизвлеченные клетки костного мозга оказались преимущественно мононуклеарными, с разбросанными каплями жира, видимыми по всему полю. К пятому дню культивирования веретенообразные клетки начали проявляться и достигли примерно 60-80% слияния, продолжая увеличиваться в плотности к седьмому дню. С первого по третий пассаж стромальные клетки костного мозга сохраняли веретенообразную или веретенообразную морфологию, образовывали прозрачный монослой с взаимосвязанными колониями и не проявляли признаков апоптоза, таких как цитоплазматическая зернистость или ядерная фрагментация. Проточная цитометрия подтвердила, что CD29, CD44 и Sca-1 были высоко экспрессированы в стромальных клетках костного мозга. Экспрессия маркеров CD31 и CD45 эндотелиальных и кроветворных линий была незначительной. Количественное определение маркеров также подтвердило высокие уровни экспрессии CD29, CD44 и Sca-1 по сравнению с CD31 и CD45.