Оценка передачи сигналов о клеточной смерти с помощью иммунофлюоресценции на модели ишемического инсульта у крыс

Ишемический инсульт является основной причиной смертности и инвалидности во всем мире. Наша работа сосредоточена на лекарственных мишенях для лечения инсульта. Нас интересуют несколько новых мишеней, таких как RUNX1 и катепсины. Для оценки этих мишеней мы разработали модель ишемического инсульта на крысах путем окклюзии средней мозговой артерии.

Мы моделируем ишемический инсульт у крыс путем введения нити для окклюзии средней мозговой артерии. Модель окклюзии средней мозговой артерии является наиболее часто используемой моделью на грызунах для доклинических исследований инсульта в сочетании с другими методами, такими как TTC, иммунофлуоресценция и окрашивание по методу TUNEL. Мы можем исследовать патофизиологию инсульта в комплексном подходе. Существуют некоторые технические проблемы, связанные с иммунофлуоресценцией, такие как специфичность антител, минимизация фона флуоресценции и оптимизация соотношения сигнал/шум за счет использования свойств флуоресцентных меток и специфических антител. Иммунофлюоресценция позволяет нам понять сложный ландшафт клеточной архитектуры и молекулярные взаимодействия с моделью окклюзии средней мозговой артерии.

Ряд тканей мозга потенциально может быть спасен при соответствующем временном окне инсульта. Наши результаты показывают, что экспрессия катепсина В активируется в ряде головного мозга крыс после окклюзии средней мозговой артерии. Он сопровождается усилением апоптоза. Дальнейшие исследования механизма, лежащего в основе передачи сигналов о клеточной смерти, могут дать новую мишень для лекарственного препарата.

В нашем будущем исследовании мы продолжим изучать потенциальные молекулярные мишени в воспалительных путях и передаче сигналов о клеточной смерти. Мы надеемся, что некоторые из этих мишеней, обнаруженных в ходе экспериментальных исследований, могут быть переведены в клиническую терапию, тем самым улучшая выживаемость и качество жизни пациентов с инсультом.

[Рассказчик] Для начала поместите крысу под наркозом в положение лежа на спине и поддерживайте температуру ее тела на уровне 36,5 °C с помощью регулируемого теплового коврика и ректального датчика температуры. Побрейте кожу на шее и продезинфицируйте ее с помощью дезинфицирующего раствора йодофора. Далее сделайте разрез по средней линии на шее на 2 см и оттяните мягкие ткани, чтобы обнажить сонные сосуды. С помощью щипцов изолируйте правую общую сонную артерию, или CCA, наружную сонную артерию (ECA) и внутреннюю сонную артерию (ICA). Перевязывайте проксимальный отдел правой ОСА с помощью швов. Затем зажмите нужные ВСА и ЭКА в их начале с помощью микрозажима. Вставьте нейлоновую мононить, покрытую круглым силиконовым наконечником, в просвет ОСА через небольшой разрез и завяжите узел в ОСА, чтобы предотвратить кровотечение и смещение мононити. Откройте правый микрозажим ICA и вставьте монофиламент в правую среднюю мозговую артерию (MCA) через культю ICA до тех пор, пока силиконовый наконечник не закроет начало MCA. Отрежьте обнаженную часть нейлоновой мононити и закройте разрез на шее по средней линии. Через два часа после окклюзии СМА откройте разрез на шее и развяжите узел в ОСА. Затем извлеките нейлоновую мононить для реперфузификации MCA. После операции наблюдайте за крысой во время восстановления после анестезии в отапливаемой клетке, поддерживаемой нагревательным ковриком с регулируемой температурой. Используя шкалу поведенческой оценки Зайи, оцените неврологические функции через два часа после окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) и через 22 часа после реперфузии. После выделения всего мозга от крысы модели MCAO, заморозьте мозг при температуре -20 °C на 20 минут. Разрежьте замороженный мозг на шесть корональных срезов с расстоянием между срезами 2 мм. Окрашивайте ломтики 2% TTC в течение 15 минут при температуре 37 °C в темноте. Затем зафиксируйте срезы мозга 4% параформальдегидом на 24 часа при комнатной температуре. Сфотографируйте окрашенные срезы с помощью цифровой камеры, настроенной в автоматический режим для объектов крупным планом. Перенесите изображения на компьютер и используйте программное обеспечение ImageJ для измерения размера инфаркта. Рассчитайте размер инфаркта как отношение суммы площади инфаркта во всех шести срезах к сумме общей площади мозга в тех же срезах. Значительные площади инфаркта наблюдались в группе MCAO по сравнению с отсутствием инфаркта в группе симуляции. Для иммунофлюоресцентного анализа зафиксировать интактный мозг модельной крысы MCAO в 4% параформальдегиде на 24 часа. Затем обезвоживайте мозг в серии градиентов раствора сахарозы в концентрациях 10%, 15% и 30%, в концентрациях 10%, 15% и 30%, продолжая до тех пор, пока ткань не опустится. Поместите обезвоженный мозг в состав с оптимальной температурой резки и удалите все пузырьки воздуха. Snap заморозьте мозг в жидком азоте. На криостатике разрежьте мозг толщиной 5 мкм. После уравновешивания замороженных участков мозга при комнатной температуре промойте их трижды стерильным PBS по 5 минут каждый. Обведите ткань с помощью иммуногистохимического пера перед инкубацией с 20 мкг на мл протеиназы К и 0,3% Triton X-100 при комнатной температуре в течение 10 минут. После промывания срезов PBS нанесите 3% BSA на очерченную ткань и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа для блокировки. Замените блокирующий раствор подходящим первичным антителом и инкубируйте срезы в течение ночи в темноте при температуре 4 °C. На следующий день промойте срезы три раза стерильным PBS, содержащим 0,1% Tween-20 в течение 5 минут каждая. Добавьте соответствующее вторичное антитело, конъюгированное с необходимым флуорофором, и инкубируйте срезы во увлажненной камере в течение одного часа, защищая их от света. После промывки секций PBS, содержащим Tween-20, окрасьте их монтажным средством, содержащим ДАППИ, и накройте покровными стеклами. На флуоресцентном микроскопе установите длину волны возбуждения равной 488 нм, длину волны излучения 520 нм и время экспозиции 500 мс, чтобы захватить окрашенный участок мозга imВозрастов. Иммунореактивность катепсина В была достоверно повышена в ишемизированном ядре группы MCAO по сравнению с фиктивной группой. Иммунореактивность катепсина В была значительно повышена в коре полутени в группе MCAO по сравнению с фиктивной группой. Существенной разницы в иммунореактивности катепсина В между ишемическим ядром и полутеневой корой не наблюдалось. Для начала обезвоживайте фиксированные параформальдегидом срезы мозга крысы модели MCAO с увеличением концентрации этанола в течение 35-50 минут каждый. Затем обработайте срезы мозга прозрачным биологическим средством типа скипидарного масла 1 в течение 35-50 минут, а затем очищающим средством 2 в течение 35-50 минут, пока ткань не станет полностью прозрачной. Теперь погрузите срезы мозга в среды для встраивания 1, 2, 3 и 4 последовательно по 60 минут каждая. Поместите срезы мозга в закладную кассету, плотно запечатайте их и храните в холодильнике для застывания. С помощью микротома обрежьте тканевый блок с точностью до 10 мкм, затем нарежьте его с точностью до 5 мкм. Дайте срезам ткани поплавать на водяной бане при температуре 45 °C в течение 30 секунд, а затем перенесите их на предметные стекла. После высыхания депарафинизируйте участки мозга в очищающем средстве в течение двух циклов по 10 минут каждый. Затем регидратируйте участки мозга в уменьшающейся концентрации этанола. Теперь промойте секцию три раза в PBS по пять минут каждый. После удаления лишней влаги добавьте по 100 мкл протеиназы К в каждую секцию и инкубируйте при 37 °C в течение 20 минут. После промывки PBS нанесите 100 мкл концевого буфера для уравновешивания дезоксинуклеотидилтрансферазы на каждый образец и инкубируйте во увлажненной камере при 37 °C в течение 10–30 минут. Удалите буфер с помощью абсорбирующей бумаги и добавьте 50 μл рабочего раствора для маркировки из набора для анализа TUNEL. Далее нанесите рабочий раствор DAPPI на срезы и выдержите в темноте в течение пяти минут, чтобы уравновесить ядра. Промойте образцы в PBS четыре раза по 5 минут каждый. Удалите лишнюю жидкость и закройте затвор монтажной средой, предотвращающей выцветание. Отсканируйте окрашенное предметное стекло с помощью мультиспектральной системы визуализации Vectra Polaris. Окрашивание методом TUNEL показало значительное увеличение апоптоза, при этом в полутеневой коре группы MCAO было больше TUNEL-положительных клеток по сравнению с модельной группой.