Покадровая эпифлуоресцентная микроскопия гетерогенных фенотипов Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus

Исследования нашей лаборатории сосредоточены на том, почему антибиотики не помогают. В частности, нас интересуют несколько клеток, называемых персистентными в бактериальных популяциях, которые предположительно должны быть убиты антибиотиком, но они могут выжить при лечении антибиотиками. Считается, что эти стойкие препараты вызывают рецидив инфекций после окончания лечения антибиотиками.

Поэтому нам интересно изучить экспрессию генов и метаболизм этих персистентов, чтобы лучше понять их стратегии выживания. В настоящее время задача области персистентов заключается в том, чтобы сбалансировать пропускную способность с чувствительностью одной клетки. Нам нужно сопоставить способность одной клетки к делению после лечения, которая будет квалифицировать ее как персистентную, с некоторым измеримым фенотипом, который может помочь нам понять внутреннюю работу клетки.

И нам, возможно, придется сделать это для тысяч клеток, чтобы захватить хотя бы один персистент. Наш протокол был разработан таким образом, чтобы его можно было легко внедрить по сравнению с неточными методами сэндвич-слоя агара или изготовлением микрофлюидных устройств, которые могут быть технически сложными. Мы обнаружили, что наш протокол обеспечивает воспроизводимую и стабильную визуализацию с течением времени с минимальным количеством материалов, что означает, что он является как экономически эффективным, так и минимально расточительным для качественного сбора данных.

В нашем будущем исследовании будет использоваться комбинация омических и одноклеточных подходов для изучения того, как патогены реагируют на лечение различными классами антибиотиков и восстанавливаются после него. Наша конечная цель состоит в том, чтобы использовать это понимание для разработки новых стратегий улучшения лечения клинических инфекций. Для начала поместите стерильную 30-миллиметровую крышку на дно основания из нержавеющей стали сменной формы для крышек.

Аккуратно вденьте вставку из поликарбоната в основание, убедившись, что крышка образует основание камеры, и запечатайте ее на месте, спрессовав прикрепленное силиконовое уплотнительное кольцо. Поместите изготовленный на 3D-принтере разделитель напротив 30-миллиметрового защитного стекла, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение модальных ячеек. Приготовьте 1,5%агарозу в конической пробирке объемом 50 миллилитров с использованием выбранной среды и аккуратно перемешайте.

Ослабьте крышку конической трубки и поместите ее в стеклянный стакан или держатель, безопасный для микроволновой печи. Разогрейте агарозную смесь в микроволновой печи на высокой мощности, останавливаясь каждые три-четыре секунды, чтобы взболтать и перемешать, чтобы предотвратить образование пузырей. Через минуту проверьте, не осталось ли в смеси нерасплавленной агарозы.

Если агароза равномерно чистая, дайте агарозе немного остыть примерно до 60 градусов по Цельсию. Добавьте соответствующие антибиотики или матрицы и аккуратно перемешайте, избегая образования пузырьков. Пипеткой внесите два миллилитра агарозы в камеру с помощью 30-миллиметрового покровного стекла.

Аккуратно положите стерильную 25-миллиметровую крышку на агарозу в верхнее отверстие камеры. Дайте прокладке застыть в течение одного-двух часов. Когда прокладка затвердеет, используйте перманентный маркер с тонким наконечником, чтобы отметить местоположение и идентичность каждого образца на 25-миллиметровом защитном листе.

Переверните камеру так, чтобы опорное кольцо из нержавеющей стали было обращено вверх, и осторожно удерживайте вставку из поликарбоната под ней, откручивая основание. Отложите основание из нержавеющей стали в сторону. Сдвиньте 30-миллиметровую крышку, соскользните с агарозной прокладки и выбросьте ее.

Разбавляйте клеточные культуры Pseudomonas aeruginosa или Staphylococcus aureus в PBS до разреженной плотности, пригодной для визуализации отдельных клеток. Энергично проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы равномерно распределить клетки. Найдите пять микролитров разбавленных клеточных суспензий в отмеченных местах на агарозной подушечке.

Как только пятна высохнут, наденьте на прокладку новую стерильную 30-миллиметровую крышку. Затем возьмитесь одной рукой за вставку из поликарбоната и медленно наденьте основание из нержавеющей стали на защитное стекло. После того, как камера будет запечатана, проверьте, не соприкасается ли агароза с поверхностью 30-миллиметрового защитного стекла.

Тупым концом пинцета осторожно надавите на 25-миллиметровый покровный клинок, пока агароза не коснется 30-миллиметрового покровного стекла равномерно по его поверхности. Для начала подготовьте микроскоп и камеру визуализации к контролю окружающей среды, установив температуру в верхнем инкубаторе и инкубаторе с большой камерой на уровне 37 градусов Цельсия. Далее включите камерный увлажнитель воздуха.

Поместите один препарат агарозной прокладки в инкубатор на верхней стадии и закройте камеру, чтобы обеспечить равновесие. Подготовьте программное обеспечение MetaMorph к получению изображений, настроив встроенный алгоритм автофокусировки для использования фазового канала во время многомерной съемки. На вкладке Stage (Стадия) задайте несколько позиций сцены для каждой выборки, ориентируясь на поля зрения с равномерно распределенной плотностью ячеек.

Затем на вкладке Time-Lapse настройте продолжительность и частоту получения изображений. На вкладке Длины волн задайте нужные каналы для сбора данных и отрегулируйте время экспозиции в зависимости от интенсивности сигнала образца. Как только агарозная прокладка прогреется в камере, поместите увлажняющую крышку на инкубатор на столешницу сцены.

Далее на микроскопе переключитесь из режима фазового контраста в режим дифференциального интерференционного контраста. Отрегулируйте конденсор и апертурную диафрагму, чтобы добиться правильной подсветки Kohler. После завершения регулировки переключитесь обратно в режим фазового контраста.

Перейдите к каждому положению рабочей области, отрегулируйте фокус и сбросьте положение рабочей области в новую фокальную плоскость. Нажмите на кнопку «Приобретение», чтобы начать многомерное сканирование. После захвата, чтобы скомпилировать изображения, откройте MetaMorph и используйте приложение «Обзор многомерных данных», чтобы выбрать нужные каналы или длины волн и включить все временные точки для каждой позиции сцены.

Нажмите «Загрузить изображения» и сохраните каждую компиляцию с соответствующим именем канала в виде файла TIFF. Была проведена покадровая визуализация клеток золотистого стафилококка, показывающая окрашивание йодида пропидиума по мере прогрессирования лечения антибиотиками, что указывало на повреждение мембраны. Визуализация Pseudomonas aeruginosa во время лечения антибиотиками показала клетки, которые подвергаются образованию сферопластов, филаментации и цитоплазматической конденсации, сопровождающейся окрашиванием йодидом пропидия.

Успешное приготовление агарозной прокладки и условия визуализации позволили наблюдать за тем, как золотистый стафилококк восстанавливается после лечения антибиотиками, а Pseudomonas aeruginosa восстанавливается после лечения антибиотиками, образуя большие кластеры, полученные из отдельных клеток.