Живая визуализация рециркуляции синаптических везикул в нервно-мышечном соединении расчлененных личинок данио-рерио

Мы изучаем молекулярный и клеточный механизм синаптической передачи на примере нервно-мышечного соединения личинок данио-рерио в качестве модельной системы. Нас интересует выяснение регуляторной умеренности синапса в ответ на различные физиологические и патологические состояния. Этот протокол позволяет визуализировать индуцированную потенциалом действия новую передачу в нервно-мышечном соединении личинок данио-рерио с улучшенной чувствительностью.

Мы можем контролировать синаптическую функцию, вызываемую умеренной стимуляцией, которая ранее не проверялась. Этот протокол визуализации может быть выполнен под обычным эпифлуоресцентным микроскопом и не обязательно требует использования конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Другими словами, этот метод обеспечивает экономически эффективную платформу для визуализации нервно-мышечной функции по сравнению с другими экспериментальными установками.

Для приготовления 200 миллилитров внеклеточного раствора смешайте 6,4 миллилитра 3,5 моляра натрия хлорида, 0,4 миллилитра одного моляра хлорида калия, 1 миллилитр одного моляра HEPES, 0,4 миллилитра одного моляра хлорида кальция, 0,2 миллилитра одного моляра хлорида магния и 360 мг глюкозы. Затем добавьте сверхчистую воду, чтобы довести общий объем до 200 миллилитров. Добавьте 20 микролитров 15 миллимолярного D-тубокураринового стокового раствора для приготовления 100 миллилитров внеклеточного раствора с 3 микромолярами D-тубокурарином.

Для приготовления 25 мл внеклеточного раствора, содержащего 0,02% трикаина, на 25 мл раствора добавить 0,5 мл 1%-ного раствора трикаина. С помощью микродозатора потяните капилляры тета-стекла до тех пор, пока диаметр наконечника не будет находиться в диапазоне от 3 до 10 микрометров. Наполните пипетку внеклеточным раствором.

Вставьте тонкую платиновую проволоку в каждое отверстие капилляра и держите электрод пипетки тета-стекла на держателе пипетки моторизованного микроманипулятора. Затем подключите заднюю часть каждого провода к изолятору стимулов. На 25 миллилитров внеклеточного раствора, содержащего 0,02% трикаина, в стеклянную чашку Петри перенесите личинок рыбки данио-рерио в чашку Петри для вскрытия.

С помощью двух тонких щипцов снимите кожу с личинок. Используйте первые щипцы, чтобы удерживать личинок на месте, и сожмите кожу на тыльной стороне плавательного пузыря другими щипцами. Затем с помощью скальпеля удалите плавательный пузырь, внутренние органы и голову.

Используйте стеклянную пастеровскую пипетку с отполированным огнем наконечником, чтобы перенести препарированный образец рыбки данио в камеру визуализации. Механически зафиксируйте образец капроновой нитью, приклеенной к С-образной платиновой проволоке, чтобы ориентировать ее под углом, примерно параллельным стимулирующему электроду. Перфузию образца с помощью системы самотека со скоростью 1 миллилитр в минуту проводят внеклеточным раствором, содержащим 3 микромоляра D-тубокурарин.

Далее введите электрод стимуляции в спинной мозг. Осторожно расположите кончик электрода рядом со спинальными моторными нейронами, идентифицированными как TagRFP-положительные нейроны, расположенные на вентральной стороне спинного мозга. Переместите электрод под косым углом от соседнего сегмента в целевое положение.

Чтобы начать работу на компьютере, выберите область визуализации на основе флуоресцентного изображения TagRFP в реальном времени. Убедитесь, что выбранная область включает несколько бутонов и исключает те, которые находятся вблизи границы сегмента тела. Переключите блок флуоресцентного фильтра GFP флуоресцентный фтор для визуализации.

Далее отрегулируйте интенсивность источника света для получения яркого изображения в режиме таймлапс 1 герц без насыщения. Введите время воздействия 100 в поле миллисекунд экспозиции в окне микроменеджера. Настройте программное обеспечение для получения изображений и устройство вывода цифрового ввода для синхронизации получения изображений с электрической стимуляцией.

Затем определите частоту стимуляции, количество потенциалов действия и временную задержку между началом получения изображения и доставкой стимуляции в скрипте Arduino. На основе этих настроек рассчитайте общее количество изображений, необходимых для съемки, и введите это значение в поле count окна многомерной съемки в микроменеджере. Установите интервал в 1 секунду в поле интервала для создания изображений с интервалом в 1 герц.

Для электрической стимуляции сконфигурируйте изолятор стимулов таким образом, чтобы он подавал импульсы постоянного напряжения 70 мВ с точностью до 1 миллисекунды. Выполните команду дигитайзера, чтобы начать получение изображения. Следите за процессом, чтобы убедиться в отсутствии недопустимого дрейфа изображения и в том, что фтор и реакции можно наблюдать.

Изменяйте интенсивность стимуляции, например, частоту в количестве импульсов, или регулируйте температуру в зависимости от экспериментальной цели. Сохраните цейтраферные изображения в виде стека временных рядов в формате TIFF. Для анализа были выбраны синапсы с большим увеличением сигнала, хотя все бутоны показали обнаруживаемые изменения в состоянии потенциала действия 20 Гц 100, Устойчивые ответы фтора наблюдались при высокочастотной электрической стимуляции с флуоресцентными изменениями, указывающими на экзоцитоз во время стимуляции и последующий распад, отражающие эндоцитоз и повторное закисление синаптических везикул.

Константы времени затухания флуоресценции варьировались в зависимости от стимула, интенсивности и температуры: 20 Гц 25 потенциалов действия проявлялись через 16,6 секунды, 20 Гц 100 потенциалов действия через 56,8 секунды и 50 Гц 500 потенциалов действия через 62,7 секунды.