Подготовка отмытых тромбоцитов человека для количественных исследований метаболического потока

Я изучал влияние острого воздействия эстрогена на центральный метаболизм углерода тромбоцитов и в покое, а также тромбин-активированные тромбоциты. Мы пытаемся определить, способствует ли острое воздействие эстрогена на тромбоциты увеличению риска тромбообразования при использовании оральных контрацептивов. Исследования в области женского здоровья в значительной степени недофинансируются.

Этот проект был частью более масштабного призыва NIH к устранению пробелов в знаниях о женском здоровье. Несмотря на то, что контрацептивы доступны уже более 50 лет, мы до сих пор не знаем точный механизм, который приводит к более высокому тромботическому риску. Биологическая изменчивость.

Традиционные методы культивирования клеток не применимы к тромбоцитам, а это означает, что тромбоциты поступают от доноров с разными генотипами. Необходимы большие размеры образцов, что подчеркивает необходимость повторяемой процедуры выделения тромбоцитов. Существующие протоколы промывания тромбоцитов написаны для специалистов в области биологии тромбоцитов.

Существует ряд уникальных проблем, связанных с работой с тромбоцитами, которые мой протокол выделяет для начинающего исследователя тромбоцитов. Для начала разогрейте водяную баню до 37 градусов по Цельсию и поместите в нее модифицированный буфер Тирода, содержащий глюкозу. Соедините цельную кровь, собранную со всех дыхательных аппаратов, в 50-миллилитровую полипропиленовую коническую пробирку.

С помощью наконечника пипетки со скошенной кромкой возьмите соответствующий объем пробы для подсчета клеток. Осторожно отсасывайте с помощью пипетки для переноса с узким отверстием, чтобы удалить образовавшиеся пузырьки. Затем дайте крови отдохнуть на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 25 минут.

Чтобы предотвратить активацию во время центрифугирования, добавьте простагландин I2 и апиразу в цельную кровь и переверните пробирку один раз, чтобы перемешать образец. Далее центрифугируйте цельную кровь при 250G в течение 15 минут без перерыва при 37 градусах Цельсия. Соберите PRP, который проявляется в виде верхнего желтого слоя над охристой шерстью и красным слоем крови, в новую наклоненную 50-миллилитровую коническую трубку вдоль стены.

Дайте PRP отдохнуть в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации смешайте PRP с 500 наномолярным простагландином I2 и 0,02 ЕД на миллилитр апиразы. Центрифугируйте смесь при 1 000 г в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия без ускорения и перерыва.

Теперь с помощью пластиковой пипетки для переноса с широким отверстием аспирируйте надосадочную жидкость для объемного объема, а затем используйте пипетку объемом в один миллилитр с необрезанным наконечником, чтобы отсосать оставшуюся жидкость рядом с гранулой. Затем добавьте простагландин I2 и апиразосодержащий буфер Tyrode's в гранулу вниз по стене конической трубки. С помощью скошенного наконечника и наконечника для пипетки объемом в один миллилитр аккуратно несколько раз повторно суспендируйте гранулу.

После того, как гранула будет повторно суспендирована, используйте пипетку с широким отверстием, чтобы перенести ее в новую коническую трубку, оставив все эритроциты или заметно слипшиеся клетки. Затем возьмите образец для проточной цитометрии с помощью наконечника пипетки со скошенной кромкой. Инкубируйте остальные тромбоциты в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы действие ингибиторов прекратилось.

После инкубации аккуратно перемешайте образец с помощью пипетки с широким отверстием и аликвотируйте образцы для проточной цитометрии. Среднее извлечение тромбоцитов из цельной крови составило около 52%, при этом контаминация лейкоцитов оставалась ниже 0,1% после процесса мытья. Экспозиция P-селектина была низкой на протяжении всего процесса стирки, но значительно увеличилась после лечения тромбином.

Уровень связанного фибриногена первоначально подскочил после первого вращения 1000G, но упал ниже 5% после второго спина, снова значительно увеличившись после лечения тромбином. Тромбоциты были успешно закрыты на размер, синглеты и положительный результат CD42a перед измерением маркеров активации. Лечение тромбином приводило к значительному увеличению экспрессии Р-селектина и фибриногена по сравнению с контролем.

Для начала получите отмытые тромбоциты из образцов человеческой крови. Предварительно охладив микроцентрифугу до нуля градусов Цельсия, соберите тромбоцитарную суспензию в частично замороженном физиологическом растворе в соотношении 1:6. Центрифугируйте смесь при 16 000G в течение 10 минут при нуле градусов Цельсия.

Отсадите надосадочную жидкость в отдельную микроцентрифужную пробирку. Далее добавьте в закаленную гранулу 0,5 миллилитра предварительно охлажденного метанола:вода при температуре минус 20 градусов Цельсия и энергично ворксируйте в течение одной минуты. Заморозьте образец в жидком азоте и разморозьте при нуле градусов Цельсия.

Снова центрифугируйте суспензию при 16 000G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и соберите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку. После сушки надосадочной жидкости в течение ночи суспендируйте сухой экстракт в 150 микролитрах воды класса LC/MS и перемешайте в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Кратковременно переведите экстракт в микроцентрифужную пробирку толщиной 0,22 микрометра для удаления клеточного мусора.

Центрифугируйте образец в течение пяти минут при температуре 16 000 G и четырех градусах Цельсия. После центрифугирования нанесите пипеткой еще 50 микролитров воды на фильтр и снова центрифугируйте в течение пяти минут при температуре 16 000 G и четырех градусах Цельсия. Наконец, соберите фильтрат для анализа.

Выработка лактата была положительной во всех донорских образцах при постоянном потреблении глюкозы и ацетата, при этом тромбин усиливал эти потоки.