Оценка микроглиального фагоцитоза миелиновых остатков in vitro при повторной магнитной стимуляции

[Инструктор] В рамках нашего исследования сосредоточены исследования в области нейрореабилитации и магнитной симуляционной терапии. Этот протокол может дать новые идеи для магнитной стимуляции в изучении того, как она влияет на чистую функцию. В дальнейшем мы сосредоточимся на нейрореабилитации и магнитостимуляции.

[Инструктор] Для начала достаньте обезглавленную голову самки крысы. Рассекаем голову на льду. С помощью ножниц разрежьте череп пополам, чтобы полностью обнажить мозг и облегчить его полное удаление. Используйте ножницы и щипцы для тщательного и асептического иссечения оболочек, мозжечка и гиппокампа. Трижды очистите мозг с помощью PBS, чтобы удалить остатки крови или тканей. Переведите очищенный мозг на 10 миллилитров 0,32 моляра стерильного раствора сахарозы. С помощью микрохирургических ножниц разрежьте мозговую ткань на кусочки, чтобы получить смесь мозговой ткани и сахарозы. Далее переложите смесь мозговой ткани и сахарозы в стерильный гомогенизатор объемом 50 миллилитров. Добавьте 30 миллилитров 0,32 моляра стерильного раствора сахарозы. Используйте гомогенизатор для стекла объемом 50 миллилитров, чтобы измельчить ткань в течение двух минут. Для получения гладкой гомогенатной ткани мозга. Разбавьте гомогенизированную до 90 миллилитров ткань мозга 0,32 моляра стерильным раствором сахарозы, и тщательно перемешайте. Добавьте 20 миллилитров 0,83 молярного стерильного раствора сахарозы в шесть стерильных тонкостенных полипропиленовых ультрацентрифужных пробирок. Затем медленно дозируйте 15 миллилитров мозговой смеси в верхнюю часть трубок. Выровняйте объемы 0,32 моляра стерильным раствором сахарозы. Чтобы собрать сырой миелиновый мусор, сначала предварительно охладите ультрацентрифужный ротор при температуре четыре градуса Цельсия. Центрифугируйте образец при 75 000 G в течение 45 минут, затем соберите остатки миелина на границе раздела между двумя плотностями сахарозы с помощью стерильной пастбищной пипетки. Для первого изотонического разделения и очистки переложите собранный раствор миелиновых остатков в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Отрегулируйте объем до 35 миллилитров с помощью предварительно охлажденного стерильного PBS, и переложите в новую трубку гомогенизатора. После гомогенизации в течение трех минут равномерно распределите гомогенат миелиновых остатков в шести стерильных тонкостенных полипропиленовых ультрацентрифужных пробирках объемом 38,5 миллилитров. Восполните объем стерильным PBS, а затем центрифугируйте. Для второго изотонического разделения и очистки твердую белую гранулу ресуспендировать в 10 миллилитрах предварительно охлажденного стерильного PBS до получения суспензии миелиновых остатков. Распределите суспензию по ультрацентрифужным пробиркам, как и раньше, и центрифугируйте. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Суспендируйте твердую белую гранулу в шести миллилитрах стерильной PBS. Разделите суспензию миелинового мусора на шесть 1,5-центрифужных пробирок и снова центрифугируйте. Наконец, повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах предварительно охлажденного стерильного PBS после удаления надосадочной жидкости. Разморозьте необходимые остатки миелина при температуре четыре градуса Цельсия или в ледяной воде и центрифугируйте, как и раньше, в течение 10 минут. Ресуспендируйте миелиновый мусор в 200 микролитрах 50 микромольного раствора CFSE. Выдерживают суспензию при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут, затем снова центрифугируют. Выбросьте надосадочную жидкость, затем трижды промойте образцы 500 микролитрами стерильного PBS. Ресуспендируйте миелиновый мусор в 100 микролитрах предварительно охлажденного стерильного PBS для получения суспензии флуоресцентно меченного миелинового мусора. Храните образец при температуре -80 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Для повторной магнитной стимуляции in vitro установите частоту лечения на 20 Гц, интенсивность лечения на 1% от максимальной выходной интенсивности, а время стимуляции на пять секунд. Включите период отдыха в течение 20 секунд и вводите 600 импульсов в течение одного сеанса продолжительностью 2,5 минуты. После предварительного определения параметров магнитной стимуляции зафиксируйте направление катушки перпендикулярно земле и ориентируйте ее вверх. Стерилизуйте катушку магнитной стимуляции спиртом, чтобы предотвратить загрязнение клеток. После добавления 50 микромоляров CFSE поместите 1000 клеток BV-2 в 24 луночные планшеты на ночь, затем отаскайте старую среду с помощью пипетки и немедленно добавьте свежую среду без сыворотки. Замените среду на среду без сыворотки и обрабатывайте клетки одним микрограммом на миллилитр липополисахарида в течение 12 часов. После 12 часов воздействия липополисахаридов добавьте 100 мкг на миллилитр миелинового мусора в среду для совместного культивирования в темноте. Подвергайте клетки повторной магнитной стимуляции, как было показано ранее. Распылите спирт на тарелку, чтобы стерилизовать ее, прежде чем вернуть в инкубатор. После периода совместного культивирования с фрагментами миелина аккуратно промойте неабсорбированный миелиновый мусор PBS. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 15 минут. Далее добавьте в лунки 150 микролитров PBS, содержащих 10% альбумина сыворотки осла и 0,3% Triton X-100, и инкубируйте. Промыв лунки PBS, добавьте в лунки первичный раствор антител в соотношении 100 на 200, и выдержите на холоде. Затем инкубируйте клетки во вторичное антитело в соотношении от 100 до 300 в течение двух часов при комнатной температуре перед визуализацией с помощью конфокального микроскопа. Клетки микроглии BV-2 продемонстрировали значительное снижение фагоцитоза миелиновых остатков после лечения липополисахаридами. который был обращен вспять при повторном вмешательстве магнитной стимуляции. Количественный анализ подтвердил достоверное уменьшение площади миелинового мусора в клетках BV-2 в группе липополисахаридов по сравнению с контролем, с заметным увеличением в группе, обработанной липополисахаридами магнитом. Процент IBA-1 положительной микроглии, кокализованной с миелиновым мусором, был значительно ниже в группе ЛПС по сравнению с контролем, в то время как магнитная стимуляция значительно увеличивала этот процент. В группе с магнитной стимуляцией, обработанной липополисахаридами, наблюдалось зависящее от времени увеличение фагоцитоза микроглии, которое показало значительно более высокое поглощение миелинового мусора.