Криосекция и иммуноокрашивание тканей внутреннего уха мыши: от эмбриональной до взрослой стадии

Мои исследования сосредоточены на нейроразвитии улитки. В частности, я стремлюсь раскрыть основные механизмы образования SNAPS в улитке и исследовать связь между болезнью Альцгеймера и потерей слуха. Визуализация в реальном времени и генетические инструменты расширяют наши возможности по более детальному изучению структур улитки и нейронных цепей, обеспечивая более глубокое понимание устойчивости и дисфункции аудиторской системы. Публикуя этот протокол, мы хотим помочь исследователям, которые являются новичками в науке аудита, особенно тем, кто раньше не работал с улиткой. В этом руководстве шаг за шагом объясняется, как подготовить образцы внутреннего уха эмбрионов, новорожденных и взрослых мышей. Наша цель состоит в том, чтобы упростить эксперименты с внутренним ухом и обеспечить надежность и согласованность результатов. Иммуноокрашивание поперечным сечением имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами, такими как иммуноокрашивание целиком. Он хорошо сохраняет белки и нуклеиновые кислоты и создает тонкие, почти 2D-срезы, что делает измерения более точными и последовательными. Этот метод также сохраняет все типы кохлеарных клеток нетронутыми и видимыми, улучшая культ иммуноокрашивания. В отличие от цельных препаратов, поперечное сечение сохраняет важные структуры, такие как спиральная связка, сосудистая полоска, мембрана Рейсснера и текториальная мембрана.

[Инструктор] Для начала поместите молодую усыпленную мышь на хирургическую платформу. С помощью тонких ножниц для препарирования осторожно сделайте разрез по средней линии вдоль волосистой части головы, начиная от шеи и продолжая по направлению к морде. Далее поместите нижнее лезвие ножниц в большое затылочное отверстие, а верхнее лезвие - в череп. Разрежьте верхнюю половину черепа до носа, чтобы завершить второй разрез. Вытащите ножницы из частично надрезанной головки. Поместите нижнее лезвие ножниц в нижнюю часть черепа, а верхнее лезвие в большое отверстие. Разрежьте нижнюю половину головы до носа, чтобы завершить третий разрез. С помощью тонких щипцов и ножниц осторожно отделите все мягкие ткани, окружающие височную кость, включая мозг, мышцы и соединительную ткань. Затем поместите половинки головы мыши в лунки 24-луночной пластины, содержащей PBS. Замените PBS на 4% раствор параформальдегида для фиксации и выдержите в течение 45 минут при комнатной температуре. После фиксации прополощите ткань три раза в течение пяти-10 минут с помощью PBS. Найдите височную кость или капсулу внутреннего уха в половине головы мыши. С помощью тонких щипцов осторожно отсоедините мягкие ткани, окружающие капсулу внутреннего уха. После ослабления разрежьте ткань вокруг капсулы внутреннего уха. Затем слегка надавите на область, окружающую капсулу внутреннего уха, с помощью щипцов, чтобы полностью освободить ее. Храните образцы внутреннего уха в PBS при температуре четыре градуса Цельсия. Для начала поместите взрослую усыпленную мышь на хирургическую платформу. С помощью острых ножниц для рассечения сделайте разрез по средней линии вдоль волосистой части головы, начиная от шеи и продолжая по направлению к морде. Отогните кожу, чтобы обнажить череп во время первого разреза. Поместите нижнее лезвие ножниц в большое затылочное отверстие, а верхнее лезвие - в череп. Разрежьте верхнюю половину черепа до носа, чтобы завершить второй разрез. Вытащите ножницы из частично надрезанной головки. Расположите нижнее лезвие у основания черепа, а верхнее лезвие - у большого отверстия. Разрежьте нижнюю половину головы до носа по средней линии, избегая внутренних ушей. Для каждой половины головы используйте щипцы и ножницы, чтобы отделить мягкие ткани, окружающие височную кость, включая мозг, мышцы и соединительную ткань. Затем согните ткань черепа пальцами в обратном направлении и большим пальцем слегка надавите на нижнюю часть височной кости. Постепенно освобождайте кость от окружающих ее креплений. После того, как капсула внутреннего уха будет удалена, тщательно промойте ее PBS. Поместите под микроскоп чашку Sylgard, наполненную 4% параформальдегидом. Поместите в чашку одну капсулу для внутреннего уха. Осмотрите внутреннее ухо на наличие прикрепленных мягких тканей или костей и аккуратно удалите их. Определите овальное окно и аккуратно удалите стремечко с помощью щипцов. Далее с помощью тонких щипцов откройте небольшое отверстие в верхушке улитки. С помощью пипетки P20, наполненной 4% параформальдегидом, промойте улитку, чтобы обеспечить выход жидкостей, таких как разбавленная кровь или эндолимфа, через овальное окно. Перенесите неподвижную улитку в 24-луночный планшет, заполненный 4% параформальдегидом. Отметьте время и инкубируйте от 30 до 60 минут с легким помешиванием с помощью коромысла или нутатора. После инкубации промойте образец три раза в течение пяти-10 минут с помощью PBS. После окончательного промывки поместите улитку в 1,25-миллимолярную ЭДТА и дайте ей покачаться в течение двух-трех дней при температуре четыре градуса Цельсия. После лечения ЭДТА промойте улитку три раза в течение пяти минут с помощью PBS. Для начала поместите рассеченную капсулу внутреннего уха в 10% раствор сахарозы и выдерживайте при комнатной температуре в течение двух часов. После инкубации замените 10% раствор сахарозы на 20% сахарозу и выдерживайте еще два часа. Затем замените 20% раствор сахарозы на 30% сахарозу и инкубируйте образец в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день удалите половину 30% раствора сахарозы. Заполните пространство оптимальной температурой резки или составом OCT и дайте образцу отрастить от 30 минут до двух часов. Перенесите образцы в меченые криоформы, заполненные составом OCT. Проверьте ориентацию улитки во встроенном криоблоке. Позаботьтесь о внутреннем ухе; S вогнутой стороны обращены к узким сторонам криоформы для стандартных кохлеарных сечений. Далее поместите сухой лед в небольшую емкость и добавьте от пяти до 10 миллилитров диметилбутана. Поместите криоформы, содержащие ОКТ и образец, на бурлящий сухой лед, чтобы быстро заморозить блок. Перенесите криоблоки в камеру криостата, предварительно охлажденную до минус 20 градусов по Цельсию. Дайте образцам сбалансироваться в течение 30–60 минут. С помощью карандаша или ручки отметьте сторону криоблока, соответствующую положению улитки, чтобы обеспечить правильную ориентацию для секционирования. Затем добавьте небольшую ванну ОКТ в патрон и поместите на нее криоблок, следя за тем, чтобы широкая сторона без карандашной отметки была обращена вниз. Поместите патрон с ОКТ и образцом в охлажденную криостатную камеру, дав ОКТ полностью замерзнуть. Через несколько минут поместите патрон с образцом на держатель патрона так, чтобы карандашная отметка была направлена вправо или влево. На криостатике обрежьте блок, используя настройку 40 микрометров, пока ткань не станет заметной. Как только ткань станет очевидной, соберите 12-микрометровый срез с помощью предметных стекол, предназначенных для криосекции. Проверьте расположение среза под микроскопом. При приближении к поворотам улитки продолжайте уборку на 12-микрометровых срезах, периодически проверяя положение до тех пор, пока не будут срезаны все повороты улитки.