Выделение живых популяций миелоидных и эпителиальных клеток из легкого мыши

Мы изучаем восстановление легких после вирусной инфекции. Мы стремимся понять механизмы, с помощью которых иммунные клетки опосредуют восстановление эпителия, и как ремоделирование после вирусного повреждения и последующая репарация могут повлиять на будущие патологии заболевания. Этот протокол направлен на устранение несовместимости легочных перевариваний, оптимизированных для эпителиальных и стромальных клеток или иммунных клеток.

Наши исследования требуют выделения жизнеспособных клеток как из иммунных, так и из неиммунных компартментов. Кроме того, мы предложили стратегию гейтинга для подмножеств эпителия и макрофагов, которая, как мы надеемся, принесет пользу в этой области. Наша лаборатория исследует перекрестные связи между иммунными и эпителиальными клетками в дыхательных путях в условиях устойчивого состояния и в ответ на вызовы окружающей среды.

Наша конечная цель состоит в том, чтобы определить, как лучше всего модулировать эту коммуникацию для улучшения восстановления тканей и предотвращения развития заболеваний. Для начала распылите на мышь 70% этанола. С помощью тонких хирургических ножниц и щипцов номер семь сделайте разрез в области живота и разрежьте сбоку через брюшину.

Сделайте небольшой надрез в диафрагме, чтобы выпустить вакуум. Затем вырежьте диафрагму и нижнюю часть грудной клетки из полости тела, чтобы обнажить легкие и сердце. С помощью шприца объемом 10 миллилитров, оснащенного иглой 27 калибра, перфузируйте легкие пятью миллилитрами двух миллимолярных ЭДТА в DPBS.

Разрежьте вертикально через грудину и по бокам, чтобы открыть грудную клетку и обнажить трахею. Используйте тонкие ножницы и щипцы номер семь, чтобы удалить как можно больше мышц и соединительной ткани, не прокалывая трахею или легкие. Далее обмотайте трахею швом 2/0, расположив ее так, как будто нужно перевязать, но не затягивать.

Сделайте боковой надрез в трахее и вставьте катетер. Затем плотно натяните шов, чтобы зафиксировать катетер на месте. Надуйте легкие одним миллилитром DPBS с помощью шприца.

Затем медленно потяните шприц назад, чтобы вытащить DPBS. Снова накачайте легкие тем же DPBS и снова потяните шприц назад, чтобы собрать жидкость бронхоальвеолярного лаважа, или BAL. Отсоедините шприц от катетера, оставив катетер вставленным.

Выдавите собранный клапан в микроцентрифужную пробирку. Далее наполните тот же одномиллилитровый шприц одним миллилитром диспа. Приложите шприц к катетеру и надуйте легкие с помощью диспаза.

Во время удаления катетера затяните шов вокруг трахеи, чтобы предотвратить вытекание отхождения. С помощью ножниц разрежьте с боков трахею. Удалите легкие из полости тела, разрезав соединительную ткань вдоль задней части грудной клетки, одновременно подтягивая легкие и трахею вверх.

Затем удалите сердце из легких. Поместите легкие в пять миллилитров DPBS на лед. Клапан центрифуги при 400 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

С помощью пипетки аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах RPMI. Для начала рассеките пять долей легких, собранных у мыши, и отбросьте соединительную ткань. Рассеченную легочную ткань измельчите ножницами в течение одной минуты на предметном стекле.

С помощью ножниц для вскрытия переложите измельченную легочную ткань в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Затем добавьте три миллилитра смеси для переваривания и пипеткой переваривайте смесь легких вверх и вниз два-три раза. Наконец, добавьте клеточную гранулу, полученную из ресуспендированной BAL в RPMI.

Поместите трубку под углом 45 градусов в орбитальный вибростенд, установленный на 140 об/мин при 37 градусах Цельсия, на 40 минут. После инкубации извлеките трубку из шейкера и положите ее на лед. Пипеткой переваривайте легочную смесь вверх и вниз пять-шесть раз.

Отфильтруйте смесь через ячеистый фильтр 70 микрометров в новую 50-миллилитровую пробирку. Промойте все оставшиеся клетки через фильтр и нейтрализуйте ферменты 10 миллилитрами 5% FBS в среде RPMI. Центрифугируйте образец при 600 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора. Ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре буфера для лизиса ACK и инкубируйте в течение трех минут при комнатной температуре для лизирования эритроцитов. Затем добавьте девять миллилитров PBS и пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать раствор.

Снова центрифугируйте образец и используйте вакуумный аспиратор для удаления надосадочной жидкости, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре буфера для сортировки клеток, активируемого флуоресценцией. Отфильтруйте суспензию через ячейку 64 микрометра в микроцентрифужную пробирку для анализа проточной цитометрии.