Мультиплексное детектирование экспрессии генов в интактном мозге дрозофилы с использованием итеративной флуоресценции in situ с помощью экспансионной флуоресценции in situ
May 2nd, 2025
Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) - это надежный метод, сочетающий экспансионную микроскопию с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) для обнаружения экспрессии нескольких генов в толстых тканях. В этом протоколе описываются последние достижения в методе и его адаптация для мечения интактной центральной нервной системы дрозофилы.
Мы разработали надежный протокол, в котором можно провести несколько раундов гибридизации in situ на одном и том же мозге дрозофилы, что позволяет визуализировать паттерны экспрессии многих различных генов. Встраивание мозга мухи в гидрогель обеспечивает превосходную целостность тканей и стабильность мРНК в течение нескольких раундов гибридизации. Это также значительно улучшает оптическую четкость при визуализации.
EASI-FISH может быть принят любой лабораторией с конфокальным или световым листовым микроскопом для определения профилей экспрессии генов типов клеток в мозге мухи. Для начала протрите незаряженное предметное стекло реагентом для обеззараживания РНК. Снимите с силиконовой прокладки непрозрачную пленку, защищающую клей.
Затем приклейте к затвору прокладку, содержащую до четырех камер. С помощью пипетки P20 покройте поверхность каждой камеры одним микролитром полилизина. Затем перенесите до четырех мозгов дрозофилы в одну пробирку объемом 0,2 миллилитра для ПЦР.
Регидратируйте мозг в 150 микролитрах PBS, содержащих 0,1% Triton X-100, а затем PBS. Добавьте по 40 микролитров PBS в каждую камеру. С помощью тонкого пинцета аккуратно расположите мозги в ряд в центре камеры, оставив между ними некоторое пространство.
Извлеките PBS из камеры и сразу же добавьте 50 микролитров 20 миллимолярного буфера MOPS. Пока мозг уравновешивается в буфере MOPS, пипетка равного объема размороженного Melphalan-X в пробирку с буфером MOPS равного объема. Затем добавьте стоковый раствор Ac-X в соотношении один к 100.
Сделайте раствор вихрем и кратковременно раскрутите его, чтобы собрать. Удалите весь буфер MOPS из камер и добавьте 50 микролитров раствора Melphalan-X Ac-X. Поместите крышку на верхнюю часть каждой камеры, не используя клей для герметизации.
Затем поместите камеру во увлажненную коробку. На следующий день осторожно снимите крышку и аспирируйте раствор Мелфалан-Х Ас-Х. Дважды промойте смонтированные мозги в 100 микролитрах 0,1% PBT, затем 100 микролитрами PBS.
Размороженные растворы TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, TEMED и персульфата аммония поместить на лед. Сделайте вихревую обработку раствора TREx-1000, чтобы убедиться в отсутствии осадка. Смешайте растворы для приготовления гелевого раствора и вортекса перед обледенением.
С помощью наконечника для дозатора извлеките PBS из камеры и удалите остатки жидкости с помощью безворсовой салфетки. Сразу же добавьте по 40 микролитров гелевого раствора поверх мозгов в каждой камере. Инкубируйте камеры при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут.
Теперь удалите раствор геля из камеры. Затем снимите прозрачную защитную пленку с поверхностного клея прокладки. Добавьте в итог 45 микролитров свежего раствора геля.
Аккуратно наденьте крышку на камеру и нажмите на защитную крышку, чтобы закрыть камеру, перед инкубацией при четырех градусах Цельсия в течение еще 10 минут. Инкубируйте камеру при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1,5 часов для полимеризации геля. После охлаждения гелей на скамейке с помощью бритвенного лезвия аккуратно снимите чехол и силиконовую прокладку.
Обрежьте гель в прямоугольную форму и обрежьте верхний правый угол, чтобы указать ориентацию образца. Затем используйте тонкую кисть, смоченную небольшим количеством буфера Pro K, чтобы осторожно снять гели со предметного стекла. Перелейте каждый гель по отдельности в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку.
Смешайте 500 микролитров буфера Pro K и пять микролитров фермента Proteinase K, и добавьте смесь в каждый гель. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день удалите буфер тонкой гибкой пипеткой, а затем промойте гели три раза в PBS по 10 минут каждый.
Инкубируйте гели в течение 30 минут в одном миллилитре буфера DNASE1 при температуре 37 градусов Цельсия. Смешайте 50 микролитров фермента DNASE1 с 450 микролитрами буфера DNASE1. Аккуратно перемешайте, не завихривая.
Инкубируйте каждый гель в 500 микролитрах раствора DNASE1 в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем промойте гели четыре раза в течение 15 минут одним миллилитром PBS комнатной температуры. Теперь инкубируйте гели в 500 микролитрах размороженного буфера для гибридизации без зондов в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
Разведите зонды в буфере для гибридизации в соотношении один к 100, приготовив 300 микролитров на гель. Инкубируйте гели с буфером для гибридизации, содержащим зонды, в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день промойте гели сначала в буфере для промывки зонда, затем в PBS.
Для проведения цепной реакции гибридизации добавьте в гель 500 микролитров амплификационного буфера и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Нагрейте флуоресцентные шпильки при температуре 95 градусов Цельсия в течение 90 секунд в ПЦР-аппарате и охладите раствор до 25 градусов Цельсия в течение 30 минут. Для каждого зонда разведите подходящие пары шпилек в соотношении один к 50 в буфере для усиления, приготовив 300 микролитров на гель.
После вортексирования смеси добавьте смесь в гели и инкубируйте. Чтобы закрепить гель для легкой листовой визуализации, дважды покройте поверхность крепления геля гелевого держателя одним микролитром полилизина, дав ему высохнуть при температуре 37 градусов Цельсия между слоями. Затем нанесите гель на покровный лист так, чтобы разрез был с левой стороны.
С помощью кисти перенесите гель на обработанную поверхность одним движением. Гены, связанные с нейротрансмиттерами и нейропептидами, демонстрировали различные паттерны экспрессии в мозге взрослой дрозофилы. VGluT и Gad1 были совместно обнаружены в одном и том же раунде гибридизации, демонстрируя неперекрывающиеся паттерны экспрессии.
AstA показал сильную экспрессию в оптической доле и более слабую экспрессию в центральном комплексе. Crz был высоко экспрессирован в pars lateralis, в то время как более низкие уровни экспрессии наблюдались в нейронах зрительной доли. Tk был обнаружен в нейронах H. delta D, идентифицированных с экспрессией Mer-GFP, с использованием специфической расщепленной линии GAL4 с помощью светового листа или конфокальной микроскопии.
FMRFamide отсутствовал в нейронах PFG, отмеченных Mer-GFP, но обнаруживался в окружающих нейронах. Визуализация нейронов FB4K с высоким разрешением подтвердила пространственное распределение транскриптов VGluT и ChAT/VAChT. Нейропептиды, такие как AstA и Crz, настолько высоко экспрессируются в некоторых клетках, что отдельные флуоресцентные пятна, представляющие собой отдельные транскрипты, больше не могут быть разделены.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В данной статье представлена техника расширенной итерации флуоресцентной гибридизации in situ (EASI-FISH), новый метод, который интегрирует расширенную микроскопию с флуоресцентной гибридизацией in situ для наблюдения экспрессии генов в толстых тканях. Метод адаптирован для центрального нервной системы Drosophila, позволяя исследователям визуализировать паттерны экспрессии множества генов в различных типах клеток.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Экспрессия генов
- Клеточная биология
Бакграунд
- Расширенная микроскопия позволяет улучшить оптическую ясность и разрешение при визуализации толстых тканей.
- Флуоресцентная гибридизация in situ является мощным методом для обнаружения экспрессии генов.
- Комбинация этих методов улучшает способность анализировать сложную структуру тканей в модельных организмах.
- Drosophila служит ценной моделью для понимания нейронного развития и функции генов.
Цель исследования
- Описать надежный протокол, который облегчает несколько раундов in situ гибридизации РНК.
- Обеспечить всестороннюю визуализацию экспрессии генов в мозге Drosophila.
- Предоставить рамки, которые могут быть легко адаптированы различными лабораториями, оснащенными базовыми микроскопическими инструментами.
Используемые методы
- В исследовании используется метод инкапсуляции в гидрогели для сохранения целостности ткани в мозге Drosophila.
- Ключевой биологической моделью является неповрежденная центральная нервная система Drosophila, акцентирующая внимание на различных нейронных экспрессиях генов.
- В статье не упоминаются рабочие процессы многоомики.
- Включены детальные протоколы обработки тканей, гибридизации и визуализации.
- Результаты валидируются путем сравнительного анализа пространственной экспрессии с использованием конфокальной или световой микроскопии.
Основные результаты
- В мозге Drosophila были обнаружены различные паттерны экспрессии генов, связанных с нейромедиаторами и нейропептидами.
- Примеры результатов включают непересекающиеся экспрессии VGluT и Gad1, что предполагает различные роли в нейротрансмиссии.
- Нейропептиды, такие как AstA и Crz, демонстрируют высокий уровень экспрессии в определенных нейронных областях, коррелирующий с функциональными последствиями.
- Этот метод позволяет точно отображать экспрессию генов по клеточным слоям и способствует пониманию взаимосвязей структуры-функции нейронов.
Заключения
- EASI-FISH представляет собой значительный прогресс в визуализации экспрессии генов в сложных тканях.
- Исследование подчеркивает дополнительное использование различных методов визуализации для получения представлений о функции генных нейронов.
- Импликации распространяются на улучшенное понимание нейронных механизмов с потенциальными приложениями в развитии биологии и нейрогенетике.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Multiplexed gene expression mapping in intact neural tissue is a critical capability for early discovery and target validation in neurobiology-focused drug development. The EASI-FISH protocol enables high-throughput, high-resolution detection of dozens of transcripts in the Drosophila brain, supporting robust comparative analyses and reducing reagent costs. This approach enhances predictive confidence in cell-type specific gene expression, informing mechanistic de-risking and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of gene expression patterns across neuronal and glial subtypes.
- Supports functional target validation by visualizing spatial transcript distribution at single-molecule resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing multiplexed detection in disease-relevant neural circuits.
- Improves predictive confidence for target selection and prioritization in neurogenetics pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed tissue systems for downstream screening and phenotypic assays.
- Standardizes assay conditions by embedding multiple brains per gel, enabling direct comparison of experimental variables.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of gene expression for reliable compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse through robust gel formulation and iterative hybridization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression mapping with translational biomarker discovery in neural tissue models.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by enabling high-throughput, cell-type specific analyses.
- Reduces biological risk in advancing neuroactive compounds by clarifying target engagement in complex tissue contexts.
Pipeline & Workflow Integration
EASI-FISH integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and translational research in neurobiology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping multiplexed gene expression in situ.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible tissue systems for quantitative evaluation of gene modulation.
- Analytics: Enables single-transcript resolution and spatial quantification for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by aligning gene expression data with disease-relevant neural circuits.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for multiplexed gene expression analysis across diverse neurobiological models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in gene expression workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroactive targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal or light sheet microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to robust imaging infrastructure and commercially available reagents.
- Demands cross-team standardization for gel preparation and hybridization protocols.
- Adaptable to other model systems with optimization of gel and probe conditions.
- Throughput and multiplexing are limited by imaging capacity and probe design constraints.
