Анализ стабильности плазмид с помощью микрофлюидики капель с открытым исходным кодом

Мы разрабатываем высокопроизводительные микрофильные методы ИС для изучения разнообразия клеточной популяции и межклеточных взаимодействий. В этом контексте гелевые микрокапли позволяют нам выполнять полезные этапы протокола, такие как лизис-окрашивание ДНК и микроскопия в сильно парализованном состоянии в захваченных клетках. Микрофильные рабочие процессы известны своей сверхвысокой производительностью и универсальностью, но их внедрение часто ограничено потребностью в высококлассных инструментах и специализированных знаниях.

Наш протокол улучшает традиционные методы с использованием высокопроизводительного анализа одиночных клеток с флуоресцентным окрашиванием и доступным рабочим процессом микроскопии с открытым исходным кодом. Он инкапсулирует клетки в гелевые микрокапли с помощью микрофлюидики для одновременного анализа миниклеток и микроколоний. В то время как объемным и планшетным культурам не хватает специфичности и разрешения, этот метод позволяет получить точную и репрезентативную статистику различных явлений.

Наши протоколы сочетают в себе капельную микрофлюидику, флуоресцентную микроскопию и аппаратное обеспечение с открытым исходным кодом методом на основе меток. Такой подход делает анализ одиночных клеток более гибким и доступным, позволяя научному сообществу решать сложные научные вопросы, касающиеся микробных сообществ. Для начала нагрейте агарозу со сверхнизкой желирующей температурой до концентрации от 2% до 90 градусов Цельсия в бульоне Luria Bertani, или LB.

Встряхните смесь в течение 10 минут в шейкере с регулируемой температурой, затем уменьшите температуру термошейкера до 39 градусов Цельсия, чтобы охладить раствор агарозы. Поместите трубку для суспензии кишечной палочки в термошейкер на четыре минуты, чтобы нагреть ее до 39 градусов по Цельсию. Смешайте бактериальную суспензию и раствор агарозы в соотношении один к одному, чтобы достичь концентрации агарозы 1%, с клеточной суспензией 3,1 умножить на 10 в степени шести клеток на миллилитр.

Приготовьте отрицательный контрольный раствор для контроля загрязнения с помощью ЛБ и агарозной суспензии в соотношении один к одному. Получите полноценную платформу расхода с открытым исходным кодом, включая драйверы давления газа и датчики расхода. Включите в установку нагреватели предметного стекла и наконечника пипетки для контроля температуры образца агарозной ячейки при его входе в чип.

Затем расположите микрофлюидный чип на предметном столике микроскопии, усиленном стробоскопией, убедившись, что место образования капель будет видно. Установите нагреватель наконечника пипетки и нагреватель предметного стекла на 40 градусов Цельсия с помощью интерфейса программного обеспечения для управления. С помощью шприца с трубкой и пробкой PDMS загрузите 1%-ную смесь суспензии агарозных клеток в наконечник для пипетки объемом 200 микролитров.

Вставьте наконечник в нагреватель наконечников и поместите его на входе водной фазы в микрофлюидном чипе. Замените уплотнение PDMS наконечника на уплотнение, подключенное к трубке системы регулирования потока. Затем вставьте масляную трубку во второе впускное отверстие, а конец выпускной трубки в сточную трубку.

Затем установите давление на 80 миллибар для фаз согласия и масла в пользовательском интерфейсе и начните инфузию суспензии клеток и масла. Отрегулируйте масляную фазу до 320 миллибар, а фазу согласия до 180 миллибар. Подождите одну минуту для стабилизации образования капель.

Как только образование капель стабилизируется, перенесите выпускную трубку из сточной трубки в сборную трубку. Продолжайте собирать капли на льду до тех пор, пока резервуар для образца не опустеет. После сбора поместите пробирки при температуре четыре градуса Цельсия на один час, чтобы агарозный гель проник внутрь капель.

Инкубируйте гелевые микрокапли, содержащие бактерии, и капли отрицательного контроля при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов или в течение ночи для роста колонии. После инкубации с помощью трехмиллилитрового шприца с иглой 21 калибра аккуратно удалите как можно больше масла с основания микрокапельной эмульсии геля. Перенесите 50 микролитров микрокапель геля в новую микропробирку, и храните ее при четырех градусах Цельсия для дальнейшего анализа капель, добавьте смесь фторированного масла с ПФО один к одному в объеме, равном оставшейся эмульсии.

Затем добавьте примерно 200 микролитров 0,9% буфера хлорида натрия поверх эмульсии. Сделайте смесь вихревой и кратковременно раскрутите ее в центрифуге с постоянной скоростью. Осторожно удалите масляную фазу с нижней части раздела жидкости и слейте 100 микролитров раствора хлорида натрия сверху.

Перенесите два микролитра гелевых микрокапель в предметное стекло камеры для визуализации и добавьте пять микролитров фторированного масла, чтобы сформировать монослой капель для оптимальной визуализации. На микроскопе активируйте белую светодиодную подсветку матрицы сверху для получения изображений в светлом поле. Монтируем подготовленную горку.

Сосредоточьтесь на образце, чтобы найти монослой капель и получить светлопольное изображение. Затем отрегулируйте колесо фильтров так, чтобы оно совпало с зеленым фильтром длины волны. Переключитесь на 470-нанометровый светодиод для возбуждения, и, не перемещая образец, получите флуоресцентное изображение колоний.

Перенесите два микролитра микрогелей, окрашенных йодидом пропидия, в чип камеры визуализации и добавьте пять микролитров 0,9% раствора хлорида натрия, чтобы получить монослой микрогелей. Загерметизируйте входное и выходное отверстия чипа, чтобы предотвратить испарение во время визуализации. Настройте фильтр красного интервала длин волн для визуализации йодида пропидия и захватите светлопольные и флуоресцентные изображения.

Инкапсуляция клеток в микрокаплях геля была подтверждена с помощью светлопольной микроскопии, которая показывает однородные капли с отчетливыми инкапсулированными клетками. Колонии, утратившие плазмидно-кодируемую флуоресценцию, были идентифицированы с помощью анализа соотношения флуоресценции. Из 2 785 проанализированных колоний 100 колоний утратили флуоресценцию, что указывает на уровень потери плазмид в 3,6%