Усовершенствованная методика доставки жидкости в легкое мыши: интубация с помощью потребительского отоскопа

[Диктор] Улучшена методика доставки жидкости в легкие мыши. Интубация с помощью потребительского отоскопа. Все процедуры на животных и их содержание были проверены кафедрой сравнительной медицины Тулейнского университета и утверждены в соответствии с Протоколом 1810. Прежде чем продолжить, получите одобрение IACUC и проконсультируйтесь с ветеринарным персоналом вашего учреждения. Разработка новых легочных терапевтических средств зависит от надежной, воспроизводимой доставки в легкое мыши, но традиционно полагается на интраназальное введение, орофарингеальную аспирацию путем полного вскрытия языка или хирургическое обрезание. Следующий метод имеет меньшую вариабельность по сравнению с полным языком, что позволяет использовать меньшие когорты животных. Он также гораздо менее инвазивный, чем вырубка. Процедура, шаг первый, настройка. В наборе для интубации грызунов изначально использовались суда с предохранительными клиньями для интубации. Это небольшие конические втулки, которые помещаются на гибкий катетер 20-го калибра размером в один дюйм. Они предотвращают повреждение катетера килем. Перед использованием очистите предохранительный клин с помощью прокладки для подготовки изопропанола. Наденьте чистый предохранительный клин, в данном случае зеленого цвета, на гибкую канюлю 20 калибра. Соберите другие необходимые инструменты, включая коммерческий отоскоп, мобильный телефон, подставку для мыши с носовым конусом, изогнутые, мелкозазубренные щипцы, эндотрахеальную трубку и оптоволоконный светильник, если используете. Перед использованием очистите все это с помощью пропропаноловой прокладки. Возьмите гибкую трубку длиной примерно 20 сантиметров. Согните его в U-образной форме и добавьте соединение замка приманки на одном конце. Закрепите U-образную форму завязкой. Добавьте в тюбик от двух до 300 микролитров стерильной фильтрованной воды или индийских чернил. В дальнейшем эта сборка называется пузырьковой трубкой. Возьмите шовную петлю, завязав 13 сантиметров шелкового шва нулевого размера по кругу. Поместите эту петлю в верхнюю часть подставки для мыши и убедитесь, что обе стороны шва надежно закреплены. Поместите подставку для мыши на металлическую лупу. Расположите помогающие руки вокруг того места, где будет рот мыши. Поместите мышь в индукционную камеру. Используйте постоянный расход кислорода в дозе 0,8 литра в минуту и 2% изофлурана. Обезболите мышь в достаточной степени, чтобы она не проснулась во время установки носового конуса. Не стоит значительно подавлять частоту дыхания мыши. Регулярное дыхание помогает оценить голосовые складки. Подключите отоскоп к мобильному телефону и убедитесь в стабильности видеопотока. Внимание, чтобы свести к минимуму воздействие изофторана на исследователя во время этой процедуры, используйте химический респиратор при проведении нескольких интубаций или обучении этому методу. Как вариант, проведите процедуру в нескольких лесах. Шаг второй, постановка на животных. Заберите первое животное из индукционной камеры, как только оно заснет. Зарифрите их и расположите их верхние зубы по длине шва. Слегка натяните животное, чтобы сохранить положение шва, положив мышь обратно на подставку. Отрегулируйте угол горловины немного назад, расположив горловину в небольшом разгибании на 5-15 градусов. Аккуратно надавите носовым конусом на ноздри. Не давите сильно вниз носовым конусом, так как он может помешать наложению швов, подвешивающего мышь. С помощью больших, мелко зазубренных щипцов крепко обхватите язык как можно ближе к нижней губе. Сильно потяните его вниз и в сторону от верхних зубов к боковым нижним зубам. Осторожность, длительное вытяжение, чрезмерное напряжение или раздавливание языка могут поставить под угрозу здоровье животных. Пожалуйста, следите за признаками травмы, включая синяки, кровотечение, отек или высыхание языка. Если таковые наблюдаются, прервите процедуру и сообщите об этом ветеринарному персоналу. Если вы используете помогающие руки, опорите щипцы в этом положении. Подавайте оптоволоконный свет, если он используется, через гибкий катетер с установленным предохранительным клином для интубации. Шаг третий, визуальная оценка голосовых связок и интубация. Держа отоскоп в недоминирующей руке, слегка надавите на язык. Затем направьте камеру и ее источник света, чтобы визуализировать голосовые связки у основания языка. Из-за незначительных различий в анатомии и цвете тканей используйте движение, связанное с дыханием, для подтверждения структурной идентификации. В самом начале ориентироваться в видеопотоке может быть сложно. Это ложные голосовые складки. Это и есть настоящие голосовые связки. Это отражение от щечной ткани. Это зонд и оптоволоконный свет. Это надгортанник. Это мягкое нёбо. Это rima glottidis, ваша цель для интубации. Это отоскоп губы, надавливающий на язык. Это запретный регион. При включенном оптоволоконном свете, если вы используете, подавайте канюлю вдоль отоскопа, слегка соприкасаясь с основанием языка или губной частью отоскопа. Для справки отрегулируйте угол входа, чтобы катетер был очень маленьким. Сразу после введения катетера, менее чем на один миллиметр за голосовые складки, поднимите кончик катетера так, чтобы он был почти параллелен столешнице. Это предотвращает выталкивание надгортанника дорсально в пищевод. Обратите внимание, при продвижении катетера сопротивления практически не должно быть. При возникновении сопротивления немедленно извлеките катетер и дайте дыханию нормализоваться. Если наблюдается кровотечение, обратитесь к ветеринарному персоналу. Шаг четвертый, подтверждение установки эндотрахеальной трубки. Помимо визуального подтверждения того, что трубка находится в правильном месте с помощью отоскопа, трахея оказывает меньшее сопротивление во время размещения, чем пищевод. Глубина оптического введения составляет около пяти миллиметров за пределами голосовых складок. Свет можно увидеть через горлышко в качестве вторичного метода подтверждения того, что глубина введения подходящая. Обратите внимание, что предохранительный клин для интубации должен предотвращать чрезмерную глубину установки эндотрахеальной трубки. Предохранительный клин предотвратит травму корины, однако он не обязательно должен препятствовать продвижению. Затем, удерживая эндотрахеальную трубку на месте, снимите волоконно-оптический свет. Подтвердите правильное размещение катетера с помощью метода пузырьковой трубки. Закрепите пузырьковую трубку на месте с помощью нижнего замка. Приливный объем должен быть сразу очевиден. В противном случае эндотрахеальная трубка находится на неправильном месте. Быстро удалите его и дайте мышке вернуться к нормальной частоте дыхания. Шаг пятый, интратрахеальная доставка. Как и метод вытягивания языка для родов через ротоглотку, роды с помощью интубации рискуют утопить животное. У подростков и взрослых мышей 50 микролитров — это в целом безопасный объем жидкости для доставки, достаточный для распространения по всем легким. Если для введения используется пипетка, введите пипетку нужного объема непосредственно в катетер и дайте мыши вдохнуть раствор. Для обеспечения диффузной доставки в легкие, а также доставляемой жидкости в легкие в количестве до 500 микролитров воздуха. При желании можно провести многократное углубление дозатора без риска отрицательной аспирации подаваемой жидкости. Обратите внимание, что при промывке инокулюма воздухом может потребоваться использование объема больше, чем дыхательный объем, примерно 200 микролитров. Тем не менее, употребление 500 микролитров не сопряжено с риском травматизации, так как это лишь около половины жизненной емкости. Шаг шестой, оценка выполнения. Портативный оптоволоконный фонарь может быть изготовлен из дешевых и легко доступных компонентов. Может быть использована коммерческая оптоволоконная сборка, как показано здесь. Тем не менее, достаточно крышки из конической трубки объемом 50 мл с отверстием, пробитым в ней с помощью иглы 20-го калибра, через которую подается пластиковый оптоволоконный кабель калибра .75 мм. В этом видео использовались как коммерческие, так и самодельные устройства. Репрезентативные результаты: интратрахеальная доставка с использованием интубации приводит к улучшению доставки и снижению вариабельности по сравнению с орофарингеальной аспирацией путем вытягивания языка. Прямое сравнение вытягивания языка и управляемой интубации. Трое разных исследователей с глубоким уровнем опыта или попросили независимо друг от друга ввести 50 микролитров разбавленных индийских чернил в ротоглотке путем вытягивания языка мышам C57 BL/6J в возрасте от 10 до 12 недель обоего пола. Два исследователя также доставили тот же запас и объем чернил в легкое с помощью интубации, как описано. Легкие были удалены вскоре после родов и сфотографированы с 2-кратным увеличением. Фотографии были оценены на предмет окрашенной области независимым исследователем с использованием изображения J. Она обнаружила, что при использовании интубации окрашивается большая площадь легких. Кроме того, вариабельность, выраженная в процентах отклонения от среднего значения, была снижена, если после интубации использовалась интратрахеальная доставка, а не вытягивание языка. Эта станция, используемая для управляемой интубации, подготовлена, как показано на рисунке. Слева направо: пипетки для доставки, пузырьковая трубка для подтверждения правильного размещения эндотрахеальной трубки, щипцы, шпатель, педиатрическое носовое зеркало, руки помощи, увеличительный свет, подставка для мыши с носовым конусом, волоконно-оптический зонд и индукционная камера для анестезии. Интубация обеспечивает большую доставку в легкие с меньшей вариабельностью по сравнению с аспирацией ОП. 10-недельные самки мышей с клапаном С получали дозу один раз по 10 до 11-го VG AIV 6.2 люциферазы и оценивали с помощью биолюминесцентной визуализации in vivo через семь дней. За 10 минут до визуализации им подкожно вводили люциферин. Показаны репрезентативные изображения мышей, получающих AV 6.2 люциферазу с помощью аспирации OP после вытягивания языка или интратрахеальной установки путем интубации. Орофарингеальная аспирация путем вытягивания языка приводила к распространению сигнала в различных частях верхних дыхательных путей, в то время как интубация приводила к концентрации сигнала в легких. Области интереса находятся в одной и той же области, и среднее излучение в пределах области показано на изображении. Количественная оценка сигналов люциферазы показала повышение эффективности доставки в легкие путем интубации и еще больше подчеркнула снижение вариабельности доставки с использованием этого метода. Вывод, как видно из предыдущих рисунков, межлегочная инокуляция с использованием традиционного метода вытягивания языка показывает неоднородное, непоследовательное распределение инокулята и большую вариабельность в том, сколько его достигает легких. Напротив, метод интубации приводил к более стабильной доставке как в правое, так и в левое легкое и был менее вариабельным. Убедительно продемонстрированными положительными результатами этого метода интубации являются, во-первых, воспроизводимая установка до 50 микролитров в легкие мыши, во-вторых, диффузное распределение закапываемой жидкости по всем легким и, в-третьих, уменьшение распространения инокулюма за пределы легких. Этот метод быстрый, безопасный и может быть включен в лабораторные процедуры без дорогостоящего оборудования или трудоемкого обучения.