Разделение и фракционирование белков клеточной стенки и клеточных мембран из Mycobacterium tuberculosis для последующего анализа белков

Наши исследования были сосредоточены на разработке оптимизированного метода разделения нерастворимых белков клеточной стенки и клеточной мембраны Mycobacterium tuberculosis на простые фракции для прямого протеомного и иммунологического анализов. Достижения в области электрофоретических методов теперь позволяют разделять сложные белки на меньшее количество белковых фракций, способствуя эффективному выделению на основе масс-спектров для функциональных протеомных и иммунологических приложений. Основные проблемы включают плохую растворимость гидрофобного белка, осаждение которого превышает сотню миллиграммов, и индуцированную денатурацию SDS-PAGE, что препятствует последующему применению, требующему нативного подтверждения, такого как анализы активности ферментов.

Ни один из существующих протоколов систематически не разделяет нерастворимые гидрофобные белки клеточной стенки и клеточной мембраны на определенные водорастворимые фракции для прямого протеомного и иммунологического анализа, что является ключом к пониманию функции и руководству вмешательствами. Наши будущие исследования будут сосредоточены на разработке диагностики на основе Т-клеточных антигенов и оценке их чувствительности, специфичности и эффективности в популяции ТБ для раннего и точного выявления ТБ с целью улучшения контроля заболевания. Для начала получите образцы клеточной стенки, клеточной мембраны и цитозольного белка из лизата цельных клеток бацилл Mycobacterium tuberculosis.

Солюбилизируют белки клеточной стенки и клеточной мембраны в изоэлектрически фокусирующем буфере. Добавьте 2%-ные амфолиты в диапазоне pH от 3 до 10 и от 4 до 6 в соотношении один к четырем. Теперь фракционируйте солюбилизированные белки в жидкой изоэлектрической фокусирующей системе, поддерживаемой при температуре четыре градуса Цельсия с помощью охлаждающей водяной бани.

Проводите изоэлектрическую фокусировку в соответствии с инструкциями производителя, применяя постоянную мощность 12 Вт. Соберите отдельные изоэлектрически фокусирующие фракции с помощью вакуумного насоса. Определите значения pH каждой фракции.

Нанесите 50 микрограммов отделенных фракций на SDS-PAGE и визуализируйте белки с помощью окрашивания Coomassie Brilliant Blue или серебра. Начните со смешивания фракций клеточной стенки и клеточной мембраны, разделенных IEF, с буфером образца для гель-электрофореза SDS. Нагрейте смесь до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Разделите белковые фракции во втором измерении, используя полиакриламидные гели размером 16 на 20 сантиметров с 12,5%-ным разрешающим гелем и 4%-ным стекирующим гелем. Затем используйте одну лунку для образца длиной 13 сантиметров, чтобы загрузить образец на гель. Проводите электрофорез при постоянном токе 50 миллиампер на гель до тех пор, пока фронт красителя не достигнет дна геля.

После электрофореза отбалансируйте гель в элюирующем буфере в течение 10 минут. Перенесите гель в цельный аппарат для элютера геля в соответствии с инструкциями производителя инструмента. Запустите элютер с постоянным током 250 миллиампер в течение одного часа, чтобы вымыть белки из геля, затем используйте вакуумный насос для сбора примерно 30 белковых фракций, каждая из которых имеет размер три миллилитра, из геля.

Количественно оцените концентрацию белка в элюированных фракциях с помощью анализа белка бицинхониновой кислоты. Подвергните 10 микрограммов элюированных белковых фракций анализу SDS-PAGE и визуализируйте полосы с помощью окрашивания Coomassie Brilliant Blue. В первой супернатантной жидкости: клеточной стенке, клеточной мембране и цитозольных фракциях Mycobacterium tuberculosis наблюдались отчетливые паттерны полосатости белков, что подтверждает успешное субклеточное фракционирование.

Изоэлектрическая фокусировка белков клеточной стенки показала наибольшую концентрацию белка во фракциях с рН ниже 2,5. SDS-PAGE фракций IEF клеточной стенки выявили отчетливые белковые полосы, преимущественно в фракциях с 1 по 8. Разделение белков клеточной мембраны с помощью IEF выявило основные пики концентрации белка между pH 4 и pH 10, причем самая высокая концентрация наблюдалась около pH 10.

SDS-PAGE фракций IEF клеточной мембраны показал разнообразные профили белков с более четкими полосами в фракциях с 1 по 9. Препаративное разделение SDS-PAGE белков клеточной стенки, разрешенных IEF, привело к получению фракций преимущественно менее 100 мкг на миллилитр. SDS-PAGE элюированных белковых фракций клеточной стенки демонстрировал широкий диапазон молекулярных масс белка с более концентрированными полосами во фракциях с 6 по 10.

Препаративная SDS-PAGE белковых фракций клеточных мембран показала, что более половины фракций имели концентрацию белка от 50 до 199 микрограммов на миллилитр. SDS-PAGE элюированных белковых фракций клеточных мембран выявил концентрированные полосы в полосах с 1 по 8 и с 13 по 16.