На месте Выделение и культивирование стойких почвенных бактерий с помощью изоляционного чипа (iChip)

Богатые хранилища микробов существуют в различных природных средах, таких как почва, водоемы и экстремальные условия. Тем не менее, использование этого огромного биоразнообразия в значительной степени ограничено лабораторными методами и средами. Преодоление этого культурного барьера и использование этого биоразнообразия может удовлетворить различные биотехнологические потребности, а также решить глобальные проблемы.

Например, развитие устойчивости к противомикробным препаратам стало задачей глобального общественного здравоохранения. Почвенные бактерии, которые трудно культивировать в лаборатории, могут производить новые биологически активные соединения с мощной антимикробной активностью, которые могут быть полезны для решения глобальной проблемы антимикробных систем. Огромное разнообразие микробов окружающей среды и их продуктов не было изучено, поскольку традиционные лабораторные технологии, основанные на культурах, часто приводят к выделению похожих известных микробов. Целью данного эксперимента является демонстрация высокопроизводительного культивирования стойких почвенных бактерий in situ с использованием технологии IChip. В этом протоколе мы продемонстрируем создание и использование этой технологии IChip, которая может быть использована для высокопроизводительного культивирования in situ трудно культивируемых бактерий и восстановления бактерий, продуцирующих антимикробные препараты, в качестве применения этой технологии.

[Ведущий] Для начала создайте предварительный проект верхней, нижней и средней пластин изолирующей микросхемы в презентационном программном обеспечении. Используйте параметр «Вставить форму» в программном обеспечении для презентаций, чтобы вставить круги необходимых размеров, которые будут использоваться в качестве IChip. Вставьте внутрь кружки меньшего размера, чтобы представить каналы IChip. Расположите меньшие круги в нужном порядке, чтобы подготовить предварительный дизайн верхней, нижней и средней пластин IChip. Выберите дизайн и используйте контекстное меню, чтобы сохранить предварительный проект в виде картинки. Используя предварительный проект в качестве шаблона, начните создание двухмерного проекта с помощью программного обеспечения для автоматизированного проектирования. В меню эскиза вставьте предопределенные формы, преимущественно круги, чтобы создать базовую конструкцию пластин IChip и области каналов. Используйте параметр размер, чтобы задать фактические размеры пластин и каналов. Нажмите «ОК», чтобы завершить дизайн, а затем используйте функцию выдавливания, чтобы преобразовать 2D-дизайн в 3D-модель желаемой толщины. Наконец, используйте меню «Файл», чтобы сохранить копию 3D-модели в формате файла неподвижной литографии, совместимом с 3D-печатью.

[Ведущий] Соберите все необходимые предметы, которые потребуются для сбора проб почвы, и доберитесь до места, откуда будет собрана проба. Откройте мобильное приложение геокодирования, найдите уникальный адрес из трех слов места отбора проб и запишите его. Затем запишите соответствующие метаданные образца, такие как температура, дата, время, глубина отбора проб, погода и воздействие погодных условий на объекте. Опрыскайте лопату и полистирольный ящик, в который будет посажен IChip, 70% этанола. Протрите их папиросной бумагой и дайте этанолу полностью высохнуть на воздухе. Затем используйте обеззараженную лопату, чтобы убрать любой поверхностный мусор, такой как опавшие листья или камни, чтобы обнажить верхний слой почвы. Снова обеззараживайте лопату, как и раньше. С помощью лопаты получите доступ к почве на глубину от трех до шести впускных отверстий и перенесите около четырех-пяти кг почвы с равномерной глубины в полистирольный ящик. Коробка должна быть заполнена примерно на 75%. Немедленно транспортируйте собранный грунт обратно в лабораторию. Из собранного образца почвы взвесьте один грамм почвы, свободной от мусора, камней и опавших листьев, в стерильную центрифугу объемом 50 мил, содержащую 10 мл стерильного физиологического раствора. Смешайте почву с солевым раствором во время вортекса в течение примерно 10 секунд, чтобы создать почвенную суспензию. Оставьте трубку центрифуги в непотревоженном положении на пять минут, чтобы крупные частицы почвы в трубке осели. Затем осторожно переложите надосадочную суспензию почвы в свежую пробирку, помеченную как S. Используя почвенную суспензию в качестве неразбавленного образца, проведите нулевое разбавление, переложив один мл образца в девять мл стерильного физиологического раствора в свежей пробирке. Готовьте разведение от 10 до степени минус один до 10 это в степени минус пять. Внутри шкафа биобезопасности обеззаражьте верхнюю пластину, нижнюю пластину и среднюю пластину IChip, замочив в 70% этаноле на 10 минут. Смойте излишки этанола, промыв компоненты IChip стерильной деионизированной водой, и дайте им высохнуть на воздухе в стерильной чашке Петри. Поместите среднюю пластину IChip в стерильную чашку Петри, готовую к посеву. Растопите среду СМС агар в микроволновой печи. Дайте ему остыть, а затем переложите 22,5 мл SMS агара при температуре 45 градусов в стерильную центрифугу объемом 50 мл. К этому добавляем 2,5 мл соответствующего разбавления образца почвы и хорошо перемешиваем путем мягкой инверсии, не допуская попадания пузырьков воздуха. Медленно налейте около трех-четырех мл засеянной среды агара SMS на среднюю пластину IChip, покрывающую всю поверхность. Затем дайте среде SMS агар застыть в течение примерно пяти-10 минут. Проверьте, установлен ли носитель СМС агар. Затем стерильным лезвием бритвы соскребите излишки агара SMS с поверхности металлической пластины IChip, оставив агаровые пробки в отдельных диффузионных камерах. Сняв защитный лист с одного из поликарбонатных мембранных фильтров размером 0,03 мкм, аккуратно поместите его на внутреннюю сторону верхнего лезвия IChip с помощью стерильных щипцов. Затем с помощью стерильных щипцов поместите еще один поликарбонатный мембранный фильтр размером 0,03 мкм на открытую сторону металлической пластины. Поместите верхнюю и нижнюю пластины IChip, сэндвич со средней пластиной, и поликарбонатные мембраны, стараясь совместить эти отверстия для винтов во всех пластинах, чтобы завершить сборку IChip. Плотно затяните гайки и болты для фиксации узла IChip. Создайте углубление размером больше IChip в коллекторе почвы в полистирольном боксе с помощью стерильной лопаты. Посадите узел IChip вертикально в углубление и плотно присыпьте почвой, убедившись, что все поверхности IChip полностью покрыты. Затем дайте in-situ в культуре на желаемый срок от двух до четырех недель. Во время инкубации используйте стерильную дистиллированную воду для увлажнения почвы вокруг высаженного IChip, периодически не допускайте пересыхания посеянных пробок агара SMS в диффузионной камере. После желаемой инкубации аккуратно вытесните почву вокруг посаженного IChip, чтобы восстановить ее. Затем промойте IChip стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить прилипшие частицы почвы, и перенесите его в биобезопасный шкаф для дальнейшей обработки. Открутите гайки и болт с узла IChip и аккуратно разберите IChip. С помощью стерильного щипца снимите поликарбонатные мембраны и перенесите среднюю пластину IChip в подготовленную чашку Петри. Используйте стерильный деревянный аппликатор для извлечения отдельных агаровых пробок в каждой диффузионной камере. Введите пробки агара в соответствующую среду, такую как агар SMS или агар 0,1X Tryptic Soy Bottle, чтобы попытаться культивировать в лаборатории. Затем культивируемые изоляты могут быть проверены на антимикробную продукцию обычными методами, такими как наложение агара с использованием тестовых штаммов. Здесь мы показываем репрезентативные результаты скрининга для 12 культур, IC-1–12, полученных из агаровых пробок IChip против Staphylococcus aureus ATCC 29213 и Acinetobacter baumannii B8342. Следует отметить, что культуры IC-6 и IC-8 проявляют активность в отношении грамположительных и грамотрицательных тестовых штаммов соответственно. В качестве альтернативы можно окрасить и визуализировать восстановленные агаровые пробки, содержащие культивируемые in-situ неподатливые почвенные бактерии, чтобы подтвердить рост микроколоний в условиях in-situ. Используя этот подход, можно извлекать стойкие почвенные бактерии in situ с высокой пропускной способностью. Напечатанный на 3D-принтере IChip может вместить 156 агаровых свечей. Тем не менее, необходимо выбрать правильное разведение при посеве, чтобы гарантировать, что одна бактериальная клетка будет засеяна в каждый канал IChip. Необходимые бактерии затем могут быть проверены на желаемую биологическую активность, такую как производство метаболитов, производство ферментов, производство биополимеров и т.д., если они могут быть культивированы в лабораторных условиях. Тем не менее, также вероятно, что некоторые бактерии могут не расти в лабораторных условиях, и в таких случаях нам, возможно, придется прибегнуть к метагеномным подходам, чтобы реализовать присутствие микробов и получить доступ к их биосинтетическому потенциалу. Описанный метод очень прост и может быть легко использован для биоразведки микробов в различных условиях окружающей среды с незначительными модификациями.