Трехмерный протокол дифференцировки клеток нервного гребня черепа in vitro для мультиплексного анализа

Нам интересно понять, как регулируется то или иное решение во время разработки. Органоидные модели и технологии одиночной целломики позволяют нам задавать вопросы, которые раньше были невозможны. Использование моделей органоидов in vitro позволяет нам генерировать больший объем данных, особенно для транзиторных клеточных популяций, таких как нервный гребень.

Результатом работы модели значительной вариабельности остается основная экспериментальная задача. Мы продемонстрировали, что клетки гребня черепа повторно экспрессируют гены препотентности для расширения потенциала дифференцировки. Для начала приготовьте свежий раствор коллагеназы в концентрации два миллиграмм на миллилитр в среде для нокаута DMEM.

Аспирируйте среду ЭСК из луночного планшета, содержащую от 70 до 80% сливающегося mESC. Теперь аккуратно добавьте один миллилитр PBS на стенку лунки. Покачивайте пластину, чтобы обеспечить равномерное мытье.

Извлеките PBS пипеткой и замените его двумя миллилитрами раствора коллагеназы. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-45 минут. Проверьте планшет под световым микроскопом при 10-кратном увеличении через 20 минут инкубации, а затем каждые пять минут.

Когда на колониях появятся загнутые края, энергично постучите по стороне пластины, чтобы отсоединить колонии. С помощью пятимиллилитровой серологической пипетки соберите оторвавшиеся колонии и перенесите их в 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифугируйте колонии при 16 G в течение трех минут при комнатной температуре.

Отсасывайте как можно больше среды из конической трубки, не нарушая колонии на дне. Далее добавьте в гранулу один миллилитр 0,05%-ного раствора трипсина и инкубируйте. С помощью микропипеток P1000 и P200 энергично пипетируйте суспензию вверх и вниз, чтобы диссоциировать колонии, затем добавьте два миллилитра питательной среды mESC для блокирования трипсина.

Центрифугируйте пробирку при 160 G в течение трех минут при комнатной температуре. Выведите надосадочную жидкость из пипетки, затем добавьте один миллилитр среды для дифференцировки CNCC. Подсчитайте клетки с помощью автоматизированного устройства для подсчета клеток или под микроскопом, затем разбавьте клетки в среде для дифференцировки CNCC до достижения концентрации 3000 живых клеток на 50 микролитров.

С помощью микропипетки P200 засейте 50 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета с U-образным дном, не обработанным ТЦ. Долейте в каждую лунку до 200 микролитров дифференцировочную среду CNCC и инкубируйте. Понаблюдайте за планшетом, содержащим 24-часовую культуру дифференцированных клеток, под световым микроскопом, чтобы убедиться, что на дне каждой лунки видны небольшие кластеры с четкими границами.

Поставьте тарелку обратно в инкубатор на ночь. На второй день медленно удалите по 100 микролитров среды из каждой лунки. Затем используйте микропипетку P200 с кончиком, отрезанным на три-четыре миллиметра от конца, чтобы аспирировать нейросферы вместе с оставшейся средой.

Перенесите нейросферы и оставшуюся среду в 96-луночный планшет с плоским дном, не обработанный ТЦ. Проверьте перенос под световым микроскопом. Долейте до каждой лунки 200 микролитров предварительно подогретой дифференцировочной среды CNCC.

На четвертый день отасуньте по 100 микролитров среды из каждой лунки. Замените его 100 микролитрами предварительно подогретой среды для дифференцировки CNCC, а затем снова инкубируйте. На пятый и шестой дни проверьте прикрепление нейросфер под световым микроскопом.

Убедитесь, что более светлые клетки, расслаивающиеся из нейросфер, начинают окружать его основное тело. Приготовьте рабочую среду CNCC в соответствии с указанным составом. Перед добавлением в среду бычий сывороточный альбумин отфильтровать через фильтр 0,22 микрометра.

После добавления факторов роста храните среду при температуре четыре градуса Цельсия до трех недель, обеспечивая ее защиту от света. Добавьте 100 микролитров раствора фибронектина в каждую лунку 96-луночного планшета, не обработанного ТК. Пока планшет находится в состоянии покоя, аспирируйте как можно больше дифференцировочной среды CNCC из лунок 96-луночной пластины с плоским дном, обработанным без TC.

Замените среду на 50 микролитров Аккутазы. Выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем добавьте 100 микролитров поддерживающей среды CNCC в каждую лунку, чтобы погасить аккутазу.

Удалите фибронектин из покрытых лунок приемной пластины. затем отфильтровать отделенный постмиграционный CNCC через 40-микрометровый фильтр в лунки приемной пластины. В нужный момент времени используйте микропипетку P200 с разрезанным наконечником для переноса нейросфер из 96-луночного планшета в двухмиллилитровую пробирку с низкой связываемостью ДНК.

Дав нейросферам отстояться в пробирке в течение трех минут при комнатной температуре, выпустите пипеткой как можно больше среды, после чего промойте одним миллилитром холодной PBS. Чтобы подготовить монтажные камеры, поместите на предметное стекло микроскопа три слоя двусторонней прозрачной безволокнистой ленты. Бритвой вырежьте в двустороннем скотче окошко размером три на восемь миллиметров.

Под стереоскопом с помощью среза P200 осторожно наведите пипетки нейросфер в очищающем агенте в монтажную камеру. Используйте увеличение от 2X до 4X, чтобы обеспечить поле зрения всей камеры и идентифицировать нейросферы. Поместите защитный листок на поверхность камеры и слегка прижмите его стенки, чтобы приклеить.

Культуры нейросфер в нетканевых пластинах демонстрировали равномерное прикрепление, начиная с пятого дня, в то время как культуры в чашке Петри показали переменное прикрепление и слияние нейросфер, особенно заметное на четвертый день. Вариабельность размеров нейросфер была значительно снижена в 96-луночных культурах планшетов по сравнению с культурами в чашке Петри на четвертый и седьмой дни. Диаметр нейросфер в 96-луночных планшетах варьировался от 139 микрометров до 295 микрометров на четвертый день и от 383 микрометров до 552 микрометров на седьмой день, в то время как культуры в чашке Петри показали более широкий диапазон.

Рост нейросферы был экспоненциальным с точки зрения количества клеток, увеличившись в среднем с 1082 клеток на второй день до 48352 клеток на девятый день. Рост диаметра был линейным, увеличившись в среднем со 136 микрометров на второй день до 570 микрометров на девятый день. Иммунофлуоресцентный анализ подтвердил, что нейросферы и деламинизирующие клетки экспрессируют маркеры CNCC AP2 альфа и SOX9 и маркер EMT TWIST1 на девятый и 13-й дни.

PAX7 присутствовал только в нейросферах.