Характеристика внеклеточных везикул из биологических жидкостей

Внеклеточные везикулы служат биомаркерами заболевания, отражая физиологические состояния. Наш подход позволяет извлекать обширные данные из крошечных объемов разрыва, продвигая исследования EV в биологических жидкостях. Основные экспериментальные задачи включают получение достаточных концентраций внеклеточных везикул из небольших образцов, минимизацию потерь образцов во время изоляции и оптимизацию анализа для предотвращения перенасыщения чипа или обнаружения слабого сигнала.

Этот протокол обходит этапы изоляции, сокращая время обработки, и позволяет анализировать внеклеточные везикулы из небольших объемов образцов, что делает его идеальным для ограниченных биологических образцов, таких как слезы. Неинвазивные биомаркеры имеют решающее значение для раннего выявления и лечения заболеваний роговицы. Биомаркеры внеклеточных везикул позволяют осуществлять мониторинг заболевания, проводить персонализированное лечение, повышать комплаентность пациентов и улучшать качество жизни.

Наша лаборатория впервые провела анализ внеклеточных везикул в образцах слезы пациентов с КС, выявив уникальные сигнатуры tEV. Это прокладывает путь к будущей диагностике и терапевтическим целям, ориентированным на ВВ. Для начала разложите на рабочем месте биологические образцы и чип тетраспанина.

Пипетка 70 микролитров биологических образцов человека, предварительно смешанных с раствором В набора тетраспанина человека на чип. Поместите пленку на пластину для промывки стружки, чтобы предотвратить испарение пробы. Через 16 часов поместите пластину в шайбу для стружки.

Зафиксируйте его на месте и закройте крышкой. Нажмите опцию CW-TETRA v0 на шайбе для стружки. Пока стружка промывается, приготовьте по 300 микролитров блокирующего раствора на одну стружку.

Добавьте в блокирующий раствор по 0,6 микролитра каждого антитела на чип. Ввергните блокирующий раствор с коктейлем антител, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Когда промывка чипов будет завершена, добавьте 250 микролитров блокирующего раствора с коктейлем антител поверх каждого чипа.

Затем закройте крышку и нажмите «Продолжить». Когда шайба для стружки стрекотает, снимите пластину для промывки стружки. Переместите чипсы вверх по пандусу.

Поместите пластину обратно в шайбу для стружки, убедившись, что она надежно зафиксирована на месте. Закройте крышку и нажмите «Продолжить». Для начала включите анализатор наночастиц.

Запустите программу сканирования на рабочем столе, подключенном к анализатору наночастиц. Выберите папку с чипами, чтобы выбрать каждую микросхему тетраспанина, и найдите ее в поле «Положение чипа» на патроне. Нажмите на три квадрата под Положением чипа, чтобы включить флуоресценцию.

Квадраты станут желтыми, синими и красными. Нажмите на крышку патрона и потяните за нее, чтобы снять. Затем надежно закрепите загруженные образцом чипсы тетраспанина на патроне.

Совместите колышки крышки патрона с отверстиями и придавите. Сдвиньте крышку, чтобы зафиксировать ее на месте. Затем поместите патрон на сцену и зафиксируйте его на месте.

Затем нажмите «Сканировать чипы» в программном интерфейсе, затем нажмите «ОК». Как только сцена полностью переместится в машину, закройте дверцу. Когда сканирование будет завершено, откройте дверцу, чтобы извлечь предметный столик и проверить результаты. Если сканирование прошло успешно, выбросьте чипы.

Поместите следующий набор фишек на патрон. Как вариант, верните пустой патрон на сцену. Выйдите из программного обеспечения и выключите машину, когда закончите.

Оптимальные уровни флуоресценции внеклеточных везикул наблюдались в каналах CD63, CD81 и CD9, в то время как контрольный канал MIgG оставался черным, что подтверждает специфичность контроля. CD81 был снижен для биологических жидкостей. Отсутствие флуоресценции в каналах CD63, CD81 и CD9 свидетельствует об отсутствии внеклеточных везикул.

Было очевидно перенасыщение флуоресценции, что затрудняло различение значимых данных из-за чрезмерной маркировки, особенно в каналах CD63, CD81 и CD9.