Визуализация микробной динамики метанооборота в прибрежных водно-болотных угодьях

Это исследование визуально соответствовало пространственному и временному распределению ключевых микробных генов, вращающихся метаном в прибрежных водно-болотных угодьях Южного Техаса, оно изучает, как факторы окружающей среды регулируют динамику метана. Наши результаты показывают, что обилие генов круговорота метана в прибрежных водно-болотных угодьях Южного Техаса чувствительно к условиям окружающей среды, включая соленость и сезон. В частности, mmoX, тип гена метанмонооксигеназы, наиболее распространен в более прохладное время года.

Этот протокол направлен на исследования по обнаружению микробных генов, циклирующих метан, предлагая новые инструменты для визуализации пространственной и сезонной микробной динамики, на которую влияют факторы окружающей среды. Интегрируя оптимизированные методы ПЦР с визуализацией ГИС, этот протокол обеспечивает улучшенное обнаружение и пространственное картирование генов, циклирующих метан, при этом захватывая динамические, пространственные и сезонные микробные закономерности, на которые влияют факторы окружающей среды.

[Рассказчик] Для начала приготовьте реакционную смесь для ПЦР объемом 25 микролитров с eDNA и другими компонентами. Поместите пробирки в ПЦР-машину и запустите реакцию ПЦР с соответствующими параметрами. После цПЦР приготовьте реакционную смесь для количественной ПЦР, содержащую киберзелень, за исключением матричной ДНК. В каждую ПЦР-пробирку распределите по 57 микролитров приготовленной реакционной смеси. Добавьте 3 микролитра матричной ДНК, стандартную или безнуклеазную воду в каждую пробирку и осторожно постучите по пробирке, чтобы перемешать. Аликвотировать 20 микролитров приготовленной реакционной смеси из каждой пробирки в предназначенные для этого лунки 96-луночного планшета для количественной ПЦР. Запечатайте ПЦР-планшет клейкой герметизирующей пленкой для ПЦР с помощью аппликатора. И центрифугируйте его при давлении 1000 x g в течение одной минуты, чтобы обеспечить правильное перемешивание и удалить любые пузырьки в лунках. Поместите ПЦР-планшет в термоамплификатор. Включите аппарат для количественной ПЦР и откройте соответствующее программное обеспечение, чтобы настроить протокол. Настройте программу количественной ПЦР и запустите прогон. Откройте программное обеспечение географической информационной системы ArcGIS Pro и сохраните файл проекта с именем Study Area в указанной папке на компьютере. Нажмите на Карта, затем выберите Базовая карта и выберите местность с метками в качестве базовой карты. Нажмите «Найти», затем нажмите «Поиск». Когда откроется строка поиска, введите название изучаемой области, чтобы найти ее на карте. Чтобы нарисовать конкретную область с помощью географической привязки, нажмите «Вид», затем «Панель каталога» на верхнем слое. Дважды кликните по папке из каталога и выберите необходимое имя файла. Щелкните правой кнопкой мыши файл .gdb базы геоданных. Нажмите кнопку Создать и выберите Класс пространственных объектов. После этого появится окно Создать класс объектов. Введите поле «Имя и псевдоним» и нажмите «Готово» внизу. Теперь нажмите «Просмотр», а затем «Содержание». Имя псевдонима будет отображаться на панели Содержание. Нажмите кнопку Редактировать (Edit) на верхнем слое, а затем нажмите кнопку Создать (Create (Создать). Откроется панель Создать функции. Дважды щелкните по псевдониму на панели Создать функции, и появятся опции обратной связи по настройке инструмента. Выберите линии, затем нарисуйте линии на карте, чтобы создать границу изучаемой территории. Дважды щелкните по карте, чтобы закончить. Сверните программное обеспечение ГИС и откройте электронную таблицу. Введите имя образца в первом столбце, широту во втором столбце и долготу в третьем столбце. Используйте следующие четыре столбца для данных количественной ПЦР pmoA1, pmoA2, mmoX и mcrA. Сохраните файл в формате CSV в определенной папке на компьютере. Затем откройте программное обеспечение ГИС и нажмите Добавить данные, а затем Данные о точках XY. Выберите сохраненный CSV-файл из папки в поле Таблица ввода. Переименуйте файл в окне Выходной класс объектов и щелкните Выполнить, чтобы отобразить точки выборки на карте. Теперь нажмите на строку поиска вверху и выполните поиск Kriging. Выберите файл станции отбора проб и выберите pmoA1. Затем щелкните по окружающей среде, выберите станцию отбора проб в слое и маске и нажмите кнопку Запустить. Чтобы создать компоновку карты, нажмите Вставка, Новая компоновка и выберите ANSI-Landscape. Нажмите на Рамка карты, выберите карту с кригингом и разместите все карты на раскладке, нарисовав прямоугольники. Выберите стрелку севера и разместите ее на схеме, чтобы указать направление на север. Затем выберите «Масштабная линейка», чтобы отобразить масштаб области на карте. Нажмите на Легенда, затем поместите ее на компоновку, чтобы отобразить легенды карты. Нажмите «Сетка», затем выберите любой вариант черной сетки, чтобы создать сетку с широтой и долготой. Сетка появится на панели Содержание с надписью Black Horizontal Label Graticule. Дважды кликните по Черной горизонтальной сетке, выберите Компоненты и удалите Галочки 1 и Сетку, нажав на крестик справа от них. Наконец, нажмите «Поделиться» на верхнем слое, затем нажмите «Экспортировать макет». Выберите тип файла как PDF, сохраните файл на компьютере с помощью поля Имя, установите вертикальное разрешение на 500 точек на дюйм и нажмите кнопку Экспорт, чтобы создать PDF-файл карты. Анализ цПЦР выявил пространственную изменчивость в обнаружении генов, связанных с циклированием метана, при этом гены mcrA были обнаружены во всех образцах LB и RV, но отсутствовали в образцах BC, что связывает соленость с распределением метаногена. ПЦР показала более яркие полосы для pmoA1 с парами праймеров A189-mb661, что подтверждает низкую, но обнаруживаемую распространенность в образцах RV, в то время как она отсутствовала в LB и BC. Анализ количественной ПЦР показал высокую сезонную изменчивость, при этом гены mmoX наиболее распространены в холодное время года, а pmoA1 наиболее распространены в теплое время года.