Визуализация сигналов Ca²⁺ в мелких легочных венах при физиологическом внутрипросветном давлении

В этом протоколе мы представляем новую методику регистрации и анализа сигналов Ca²⁺ во внутрилегочных венах (малых легочных венах или ЛВ) при физиологическом внутрипросветном давлении. Метод включает в себя выделение небольших PV, их инкубацию с индикатором Ca²⁺ , канюлирование и нагнетание давления, конфокальную визуализацию сигналов Ca²⁺ и анализ данных.

Сигналы кальция регулируют функцию кровеносных сосудов, различаясь по источнику и роли. Мы стремимся понять их специфические функции в сосудистой стенке и выявить аномалии, связанные с заболеванием. Большинство исследований кровеносных сосудов легких сосредоточены на артериях или капиллярах, а не на легочных венах.

Ни в одном исследовании не изучали сигналы кальция в легочных венах при нормальном внутрипросветном давлении, несмотря на их физиологическую значимость. Легочные вены претерпевают изменение давления во время кардиоциклов, но их влияние на сигналы кальция не изучено. Наш протокол позволяет регистрировать и автоматически анализировать сигналы кальция в мелких легочных венах при нормальном давлении.

Наш протокол позволяет в будущем изучить, как внутрипросветное давление влияет на сигналы кальция в мелких легочных венах, углубляя понимание их регуляции и роли в здоровье и болезнях. Для начала очистите инструменты и посуду для вскрытия в 100% этаноле, а затем вымойте их в деионизированной воде. С помощью ножниц.

Вскрыть грудную полость усыпленной мыши. С помощью щипцов аккуратно удаляют сердце и легкие из грудной полости с минимальным прикосновением к легким. Затем поместите салфетку на пластину с защитным покрытием, содержащую холодный буферизованный физиологический раствор HEPES.

Прикрепите сердце и легкие с помощью рассекающих штифтов так, чтобы были хорошо видны крупные легочные вены и легочные артерии, а левая доля легкого была слегка растянута. Используя большие легочные вены в качестве ориентиров, аккуратно удалите ткань, окружающую мелкие межлегочные вены, с помощью тонких ножниц. Затем аккуратно изолируйте мелкие легочные вены от окружающих тканей.

Далее приготовьте исходную концентрацию 2,5 миллимоляра Fluo-4 AM с ДМСО. Используя стоковый раствор, приготовьте погрузочный раствор. Поместите мелкие легочные вены в трубку объемом 1,5 миллилитра с нагрузочным раствором.

Накрываем трубку алюминиевой фольгой, выдерживаем на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Чтобы канюлировать мелкие легочные вены, удалите вену из моющего раствора. Поместите его в подготовленную камеру для миографии под давлением.

С помощью пары щипцов с тонкими наконечниками осторожно канюлируйте один конец маленькой легочной вены на одну из канюль, затем с помощью микроволокна из нейлоновой нити завяжите узел вокруг канюлированного конца маленькой легочной вены и кончика канюли, чтобы закрепить его. Осторожно протолкните физиологический раствор соли через канюлю, чтобы удалить кровь внутри легочной вены. С помощью нейлоновой нити перевяжите другой конец стеклянной канюлей с помощью микронитей.

Для визуализации кальция сначала прикрепите серворегулятор давления к трубке, содержащей буферизованный физиологический раствор соли HEPES. С помощью контроллера нагнетайте давление в мелкую легочную вену с одного конца. Теперь подключите перистальтический насос к входу, выходу и выходу и переплавите раствор.

После периода равновесия используйте 40-кратный объектив для погружения в воду и систему конфокальной визуализации с вращающимся диском для получения изображений кальция для 1000 кадров. Чтобы выполнить анализ изображений, запустите специально разработанный Spark и программное обеспечение. Используйте фильтр пять на пять и медианный фильтр для сглаживания изображений, а затем рамку, обрисовывающую плоскую область легочной вены с несколькими клетками для автоматического обнаружения событий.

Нажмите на «Просмотр» и «Автоматическое обнаружение событий». Установите пороговое значение события на амплитуде 1,3F по сравнению с F0, допуск 20%, окно сканирования — семь на семь пикселей, а среднее значение — семь на семь изображений. Нажмите «Начать поиск» или значок глаза.

Найдите таблицу событий, нажав на маленькую таблицу событий в меню просмотра, затем рассчитайте количество событий на квадрат микрометра, разделив количество обнаруженных сигналов ионов кальция на площадь выбранного кадра. Количество спонтанно возникающих кальциевых сигналов в мелких легочных венах при внутрипросветном давлении в пять миллиметров ртутного столба составило 0,73 плюс-минус 0,2 события в минуту на квадратный микрометр в базальных условиях. Добавление рианодина резко снижало сигнальную активность кальция.