Редактирование генома комара желтой лихорадки Aedes aegypti с использованием CRISPR-Cas9

Здесь мы опишем подробный протокол редактирования генома с помощью эмбриональной микроинъекции комара A. aegypti с использованием технологии CRISPR-Cas9.

Объем наших исследований заключается в создании генетически модифицированных линий от комаров с использованием технологии CRISPR-Cas9. Использование технологии CRISPR-Cas9 для подавления популяции комаров, PgSIT, а также для создания бинарных систем экспрессии для пространственно-временного контроля экспрессии генов.

Мы получили как выбивные, так и выбивные линии с использованием технологии CRISPR-Cas9. Наши нок-линии включают в себя вставку трансактиватора QF, который обеспечивает пространственно-временной контроль нижестоящих генов, таких как флуоресцентные маркеры (GFP) для тканеспецифической маркировки и репортеров нейронной активности (G-CaMP6).

Создание новых мутантных линий комаров позволит глубже понять функцию генов и нервные, физиологические и поведенческие последствия. Это может привести к разработке новых способов предотвращения передачи болезней, переносимых комарами. Наша лаборатория разработала технологию подавления популяции комаров, которая основана на технологии CRISPR-Cas9 для нокаутирования генов, связанных с мужской фертильностью и жизнеспособностью самок. Кроме того, мы создали несколько линий комаров для изучения сенсорной устойчивости комаров, в частности, обоняния и зрения.

[Интервьюер] Чтобы подготовить инъекционную конструкцию для нокаутных мутантов, разбавьте белок Cas9 до нужной концентрации с помощью буфера для разведения Cas9. Затем разбавьте аликвоту синтезированной in vitro направляющей РНК или гРНК сверхчистой водой. Предварительно смешайте разведенный белок Cas9 с каждой гРНК с образованием рибонуклеопротеинового комплекса. Затем соедините несколько предварительно смешанных растворов рибонуклеопротеиновых комплексов. Для вставок генных кассет, направленных на гомологию, разбавляйте и смешивайте белок Cas9 и гРНК. Разведите донорскую плазмиду сверхчистой водой и соедините все конструкции. Далее с помощью кварцевой нити подготовьте иглы для микроинъекций. С помощью следующей программы. Вытяните иглы с помощью лазерного съемника микропипетки. После установки ручного аспиратора смочите белую круглую фильтровальную бумагу и поместите ее либо на внутреннюю стенку, либо поверх влажной ваты внутри коллектора. Поместите в сборник от 5 до 10 самок комаров, которых кормили кровью 5-10 дней назад. Затем поместите коллектор в темноту на 45 минут. После этого извлеките комаров из коллектора. После инкубации снимите фильтровальную бумагу, чтобы собрать эмбрионы. Выберите эмбрионы до стадии бластодермы, которые имеют светло-серый цвет с бумаги для сбора урожая. Перенесите отобранные эмбрионы влажной щеткой на двустороннюю липкую ленту, положенную поверх покровного скотча. Выровняйте эмбрионы параллельно, убедившись, что они находятся рядом друг с другом так, чтобы все задние концы были обращены вперед, в то время как их окружение оставалось влажным. Во время выравнивания добавьте на эмбрионы галокарбоновое масло 700, чтобы предотвратить высыхание. На микроинжекторе установите компенсационное давление 300 гектопаскалей и давление впрыска 500 гектопаскалей. С помощью микрозагрузчика загрузите в иглу три микролитра инъекционной конструкции. Поместите защитный листок с выровненными эмбрионами на предметное стекло микроскопа и расположите его под микроскопом для инъекции. Далее закрепите иглу в иглодержателе с помощью микроманипулятора под углом 10 градусов к заднему концу эмбрионов. Осторожно откройте иглу, слегка коснувшись ее кончика к краю покровного листика. Затем введите эмбриону плазмидную конструкцию. После инъекции Aedes agyptie комарам с инъекционной конструкцией используйте безворсовые одноразовые салфетки для удаления жира, окружающего эмбрионы. Добавьте деионизированную воду для промывки эмбрионов. Переложите промытые эмбрионы на влажную фильтровальную бумагу и поместите фильтровальную бумагу на влажную салфетку в чашку объемом девять унций Karat. Затем положите на дно чашки влажную вату для поддержания влажности. Подержав эмбрионы во влажном состоянии в течение трех-четырех дней, переложите фильтровальную бумагу с эмбрионами примерно в три литра деионизированной воды в шестилитровую кастрюлю Sterilite для вылупления. Как только вылупятся личинки G zero, добавьте в кастрюлю корм для рыб, смешанный с водой. Проведите скрининг личинок G zero на наличие флуоресцентного маркера на стадии личинок третьего-четвертого возраста. Отделяйте личинок в зависимости от их флуоресцентного статуса. Поддерживайте флуоресцентно-положительные и флуоресцентно-отрицательные личинки в отдельных ваннах. Разделяйте инъекционных комаров по полу, когда они окукливаются, и идентифицируйте самцов по их меньшему размеру, более заметной и заостренной доле гениталий и более широким веслам. Идентифицируйте самок по их большему размеру, менее выраженной генитальной доле и более узким веслам. После объединения флуоресцентно-положительных или флуоресцентных отрицательных комаров каждого пола скрещивайтесь с комарами противоположного пола дикого типа Liverpool A. agyptie в соотношении от трех до пяти особей дикого типа на каждую флуоресцентную обследованную особь, позволяя им спариваться в течение четырех дней. Через три-четыре дня проведите скрининг личинок G1 на флуоресцентный маркер на стадии личинок третьей-четвертой стадий.